單獨(dú)用形態(tài)學(xué)檢查對(duì)淋巴瘤和白血病細(xì)分亞型往往不夠,常常需要做免疫表型檢查。免疫組化(IH)是為達(dá)到這一目的最常采用的技術(shù),因?yàn)樗峁┝酥苯优c形態(tài)學(xué)相關(guān)的標(biāo)記,因此病理醫(yī)生感到更有信心作出診斷。此外,免疫組化染色可以手工完成,而且通常不需要昂貴的設(shè)備。在存檔材料上能夠回顧性地進(jìn)行免疫組化,也是它很大的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。
在現(xiàn)階段,免疫組化的應(yīng)用受到能用于組織學(xué)染色的單克隆抗體的限制。經(jīng)固定和包埋后,許多抗原表位已經(jīng)改變,因此它們不再與可用于流式細(xì)胞儀的大多數(shù)抗體反應(yīng)。免疫組化的主要缺點(diǎn)是它不能顯示小淋巴細(xì)胞的表面免疫球蛋白,因此不能顯示除了如漿細(xì)胞和免疫母細(xì)胞腫瘤等胞質(zhì)豐富的腫瘤細(xì)胞外的大多數(shù)淋巴瘤中B細(xì)胞群的克隆性。
免疫組化也無法區(qū)分表面與胞質(zhì)抗原。例如,胞質(zhì)CD3存在于早期T細(xì)胞階段(胸腺細(xì)胞)而表面CD3則見于成熟的T細(xì)胞階段(外周T細(xì)胞)。當(dāng)一腫瘤用免疫組化染色呈CD3陽性時(shí),不能確定腫瘤細(xì)胞的發(fā)育階段。NK細(xì)胞(胞質(zhì)CD3陽性)和NK樣T細(xì)胞(表面CD3陽性)之間的區(qū)別,同樣也是如此。
此外,用免疫組化不能在相同細(xì)胞上作多重染色,也不能精確定量抗原以用于治療監(jiān)測(cè)。即使配以成像技術(shù),也只能得到半定量結(jié)果。
最后,免疫組化的安排通常是在HE染色的切片檢查完之后,因此得出結(jié)論起碼要等到標(biāo)本收到之后的第三天。
由于免疫組化的這些缺陷,常常需要使用流式細(xì)胞儀(FC)。用流式細(xì)胞儀,多個(gè)樣本可以同時(shí)在含10個(gè)或10個(gè)以上單克隆抗體的面板上迅速處理。在一個(gè)良好的FC實(shí)驗(yàn)室,周轉(zhuǎn)時(shí)間在3小時(shí)以內(nèi)。當(dāng)標(biāo)本足夠時(shí),流式細(xì)胞儀為每個(gè)抗原的檢查計(jì)數(shù)3000~5000個(gè)細(xì)胞。大量細(xì)胞的檢查提高了FC的靈敏度和準(zhǔn)確性,并使檢測(cè)到少量的腫瘤細(xì)胞成為可能。FC能夠在相同的腫瘤細(xì)胞上染多種抗原,而且可以區(qū)分表面與胞質(zhì)的染色。6色流式細(xì)胞儀的使用,進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的特征描述功能。流式細(xì)胞儀所獲得的各個(gè)細(xì)胞群的百分比具有高度重現(xiàn)性,因此不同的實(shí)驗(yàn)室之間有可比性。
流式細(xì)胞術(shù)主要的缺點(diǎn)是缺乏與標(biāo)記相關(guān)的形態(tài)學(xué)。換句話說,出現(xiàn)的標(biāo)記可能代表正常的細(xì)胞,也有可能是腫瘤細(xì)胞。因此,對(duì)腫瘤細(xì)胞群的識(shí)別,有賴于FC中的門控技術(shù)從正常細(xì)胞中分離出腫瘤細(xì)胞。然后腫瘤細(xì)胞可以用一組單克隆抗體進(jìn)一步鑒定。
用于免疫表型分析的單克隆抗體
自20世紀(jì)80年代初以來,已經(jīng)開發(fā)出了上千個(gè)白細(xì)胞分化抗原特異性的單克隆抗體。這些抗體分為不同的功能組,而且與相同表位反應(yīng)的抗體指定為相同的分化群(CD)。2004年12月在澳大利亞阿德萊德舉行的第八屆國(guó)際人類白細(xì)胞分化抗原專題討論會(huì)上,最后一個(gè)分化群名稱是CD339。這些抗體主要用于新鮮和適當(dāng)冰凍的細(xì)胞,而且可用于流式細(xì)胞分析(表4)。不過,越來越多新開發(fā)的抗體,能與固定好的石蠟包埋組織中的抗原反應(yīng),它們可用于免疫組化檢查(表5)。
根據(jù)與它們反應(yīng)的抗原的不同,單克隆抗體可以分為六種。
1. 系列相關(guān)抗原:其中最常見的B細(xì)胞相關(guān)抗原包括CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD38、CD79、CD138和PCA-1;常見T細(xì)胞相關(guān)抗原包括CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、T細(xì)胞受體αβ和T細(xì)胞受體γδ;NK細(xì)胞相關(guān)抗原有CD16、CD56和CD57;粒單細(xì)胞抗原有CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD33、CD64、CD68和CD117。
2. 不成熟細(xì)胞抗原:這一類包括CD10、CD34、CD117和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)。
3. 活化抗原:這一類由CD25、CD26、CD30、CD38、CD54、CD71和HLA-DR組成。
4. 組織相容性抗原:組織相容性抗原在指導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用中是十分重要的。例如,CD4細(xì)胞與攜帶HLA-Ⅱ類抗原的細(xì)胞反應(yīng),而CD8細(xì)胞與那些帶HLA–Ⅰ類抗原的細(xì)胞反應(yīng)。HLA-Ⅱ類抗原包括HLA–DP、HLA–DR和HLA–DQ。
5. 黏附分子:此類包括CD11a-CD18(淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1型)、CD44、CD56(神經(jīng)細(xì)胞黏附分子)、CD54(細(xì)胞間黏附分子1型)、CD102(細(xì)胞間黏附分子2型)、CD106(VCAM-1)和CD31(血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1型)。
6. 增殖相關(guān)抗原:了解最多的增殖相關(guān)抗原包括Ki-67和PCNA。前者常用于免疫組織化學(xué)染色以評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的增殖活性。
表4常見單克隆抗體的細(xì)胞特異性和臨床應(yīng)用
分化抗原
單克隆抗體
細(xì)胞特異性
臨床應(yīng)用
CD1a
Leu6,OKT6,T6
胸腺細(xì)胞,朗格漢斯細(xì)胞
T-ALL,T淋巴瘤,組織細(xì)胞增多病
CD2
Leu5,OKT11,T11
E玫瑰花結(jié)受體
T-ALL,T淋巴瘤
CD3
Leu4,OKT3,T3
T細(xì)胞受體復(fù)合物
T-ALL,T淋巴瘤
CD4
Leu3,OKT4,T4
輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞
T細(xì)胞亞群的鑒定
CD5
Leu1,OKT1,T1
T細(xì)胞,B細(xì)胞亞群
T-ALL,T/B淋巴瘤,CLL
CD7
Leu9,OKT16,3A1
T-細(xì)胞,IgM-Fc受體
T-ALL,T淋巴瘤
CD8
OKT8,T8t
細(xì)胞毒性/抑制性T細(xì)胞
T細(xì)胞亞群的鑒定
CD10
CALLA,OKBcALLa,J5
不成熟B細(xì)胞和T細(xì)胞
ALL,B淋巴瘤
CD11b
Leu15,OKM1,Mo1
單核細(xì)胞,粒細(xì)胞,NK細(xì)胞,抑制性T細(xì)胞
AML
CD11c
LeuM5,αS-HCL3
單核細(xì)胞,HCL的B細(xì)胞
AML,HCL
CD13
LeuM7,OKM13,My7
單核細(xì)胞,粒細(xì)胞
AML
CD14
LeuM3,OKM14,MY4,Mo2
單核細(xì)胞,粒細(xì)胞
AML
CD15
LeuM1,My1
單核細(xì)胞,粒細(xì)胞,Reed–Sternberg細(xì)胞
霍奇金淋巴瘤
CD16
Leu11
NK細(xì)胞,粒細(xì)胞,巨噬細(xì)胞
NK細(xì)胞疾病
CD19
Leu12,OKpanB,B4
B細(xì)胞
B-ALL,B淋巴瘤,CLL
CD20
Leu16,B1
B細(xì)胞
B-ALL,B淋巴瘤,CLL
CD21
CR2,OKB7,B2
濾泡樹突狀細(xì)胞,B細(xì)胞,C3d
B淋巴瘤
CD22
Leu14,OKB22,B3,αS-HCL1
B細(xì)胞
B淋巴瘤,HCL
CD23
B6,Leu20
B細(xì)胞
B淋巴瘤,CLL
CD25
IL-2,OKT26a,Tac
T細(xì)胞上的IL-2受體(Tac抗原)
HCL,成人T細(xì)胞白血病
CD30
Ki-1,BerH2
Reed–Sternberg細(xì)胞,活化T或B細(xì)胞
霍奇金淋巴瘤,間變性大細(xì)胞淋巴瘤
CD33
LeuM9,My9
單核細(xì)胞,粒細(xì)胞
AML
CD34
HPCA-1,My10
造血祖細(xì)胞
急性白血病
CD38
Leu17,OKT10,T10
漿細(xì)胞,活化T或B細(xì)胞
骨髓瘤
CD41
J15
血小板GPIIb-IIIa
原始巨核細(xì)胞白血病
CD42a,b
HPL14,AN51,10P42
血小板GPIX和GPIb
原始巨核細(xì)胞白血病
CD43
MT-1,Leu22,L60
T細(xì)胞,B細(xì)胞亞群
T或B細(xì)胞淋巴瘤
CD45
HLE-a,LCA
所有白細(xì)胞
淋巴瘤,白血病
CD45RA
MT-2
T細(xì)胞,B細(xì)胞亞群
濾泡淋巴瘤
CD45RO
UCHL1
T細(xì)胞,B細(xì)胞,單核細(xì)胞,粒細(xì)胞
T淋巴瘤
CD56
Leu19,NKH-1
NK細(xì)胞
NK細(xì)胞疾病
CD57
Leu7,HNK-1
NK細(xì)胞,T細(xì)胞亞群
NK細(xì)胞疾病
CD61
10P61,VI-PL2
血小板GPIIIa
原始巨核細(xì)胞白血病
CD64
FcγP1,gp75
單核細(xì)胞
單核細(xì)胞疾病
CD68
KP1
單核細(xì)胞,組織細(xì)胞
單核/組織細(xì)胞腫瘤
CD71
Tf受體,OKT9,T9
活化T/B細(xì)胞,巨噬細(xì)胞
急性白血病,淋巴瘤
CD74
LN2
B細(xì)胞,單核細(xì)胞
B淋巴瘤
CDw75
LN1
B細(xì)胞,T細(xì)胞亞群
B淋巴瘤
CD79a
HM47,HM56,JAB117
B細(xì)胞
B淋巴瘤
CD79b
SN8,B29/123,CH3-1
B細(xì)胞
B淋巴瘤
CD103
HML-1,B-ly7
B細(xì)胞
HCL
CD117
C-kit,干細(xì)胞因子受體
造血干細(xì)胞
AML
CD123
IL-3受體
肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞,DC2細(xì)胞,B細(xì)胞亞群
肥大細(xì)胞病,HCL,漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞腫瘤
CD138
B-B4,1D4,F59-2E9,M115
FMC-7
HLA-DR
PCA-1
血型糖蛋白A
TCR-1,βF-1,WT31
TCR-δ1,TCS1,antiδ
B細(xì)胞,漿細(xì)胞
B細(xì)胞
B細(xì)胞,活化T細(xì)胞,原始粒細(xì)胞,原始單核細(xì)胞
漿細(xì)胞,單核細(xì)胞,粒細(xì)胞
紅系細(xì)胞
T細(xì)胞
T細(xì)胞
B淋巴瘤,骨髓瘤
PLL,HCL,B淋巴瘤
B細(xì)胞腫瘤
骨髓瘤
紅白血病
T淋巴瘤/白血病
T淋巴瘤/白血病
ALL,急性淋巴細(xì)胞白血病;AML,急性髓細(xì)胞白血病;CLL,慢性淋巴細(xì)胞白血病;HCL,多毛細(xì)胞白血病;IL-2,白細(xì)胞介素2;NK,自然殺傷;PLL,幼淋巴細(xì)胞白血病;Tf,轉(zhuǎn)鐵蛋白
由于使用者不能直接看到流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)的細(xì)胞,故制定了一套標(biāo)準(zhǔn)把血液腫瘤與正常白細(xì)胞區(qū)分開。
1. 免疫球蛋白輕鏈限制:表面免疫球蛋白輕鏈的比例是最常用的診斷標(biāo)準(zhǔn),因?yàn)樗瑫r(shí)定義了B細(xì)胞譜系以及克隆性。當(dāng)一種輕鏈較其他輕鏈明顯占優(yōu)勢(shì)時(shí),就稱為輕鏈限制,它表示了單克隆性。淋系腫瘤常常伴隨單克隆性。
2. B細(xì)胞群中表面免疫球蛋白丟失:正常B細(xì)胞同時(shí)表達(dá)B細(xì)胞抗原和表面免疫球蛋白。在某些淋巴腫瘤,如原發(fā)性縱隔B細(xì)胞淋巴瘤和前體B細(xì)胞腫瘤中,檢測(cè)不到表面免疫球蛋白。
3. 同一細(xì)胞群中兩種不同的細(xì)胞系標(biāo)記共存:雙細(xì)胞系標(biāo)記已成為一些淋巴腫瘤的標(biāo)志。最常見的例子是慢性淋巴細(xì)胞白血病,小淋巴細(xì)胞淋巴瘤和套細(xì)胞淋巴瘤,同時(shí)染B細(xì)胞標(biāo)記(CD19或CD20)和T細(xì)胞標(biāo)記(CD5)。
4. 大量細(xì)胞表達(dá)不成熟細(xì)胞標(biāo)記:對(duì)于淋系腫瘤,不成熟的細(xì)胞標(biāo)記包括末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、CD10和CD34。而髓系腫瘤,則經(jīng)常表達(dá)CD34和CD117。
5. 細(xì)胞系抗原選擇性丟失一個(gè)或多個(gè):這一標(biāo)準(zhǔn)在診斷T細(xì)胞淋巴瘤中特別有用,因?yàn)門細(xì)胞沒有類似于B細(xì)胞輕鏈限制的克隆標(biāo)記。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用三個(gè)泛T細(xì)胞標(biāo)記(CD3、CD5、CD7)進(jìn)行比較。
6. 用TCR-Vβ抗體測(cè)定T細(xì)胞克隆性:一套TCR-Vβ抗體可以用來識(shí)別T細(xì)胞的克隆性。如果大多數(shù)的T細(xì)胞表達(dá)同一家族抗原,就表示可能是一個(gè)單克隆T細(xì)胞群。
Table5 免疫組化常用單克隆抗體
CD/抗原
細(xì)胞特異性
臨床應(yīng)用
ALK
ALCL細(xì)胞
ALCL
bcl-2
B細(xì)胞
B淋巴瘤
bcl-6
B細(xì)胞
B淋巴瘤
CD1a
胸腺細(xì)胞,朗格漢斯細(xì)胞
前體T細(xì)胞淋巴瘤/白血病
CD3
T細(xì)胞
T淋巴瘤/白血病
CD4
輔助性T細(xì)胞
T淋巴瘤/白血病
CD5
T細(xì)胞
T淋巴瘤/白血病
CD8
抑制性T細(xì)胞
T淋巴瘤/白血病
CD10
不成熟B細(xì)胞
ALL,濾泡淋巴瘤
CD15
Reed–Sternberg和髓細(xì)胞
霍奇金淋巴瘤
CD20
B細(xì)胞
B淋巴瘤
CD21
濾泡樹突狀細(xì)胞(FDC)
FDC腫瘤和濾泡的鑒定
CD23
B細(xì)胞,FDC
B淋巴瘤
CD30
Reed–Sternberg和活化T/B細(xì)胞
霍奇金淋巴瘤
CD34
造血干細(xì)胞
急性淋巴/髓系白血病
CD42b
血小板/巨核細(xì)胞
急性原始巨核細(xì)胞白血病
CD43
T細(xì)胞,B細(xì)胞亞群
T/B細(xì)胞淋巴瘤,髓系肉瘤
CD45
所有白細(xì)胞
淋巴瘤,白血病
CD45RA
T細(xì)胞,B細(xì)胞亞群
T/B細(xì)胞淋巴瘤
CD45RO
T細(xì)胞,B細(xì)胞亞群
T/B細(xì)胞淋巴瘤
CD56
NK細(xì)胞
NK/T細(xì)胞淋巴瘤/白血病
CD57
NK細(xì)胞
NK/T細(xì)胞淋巴瘤/白血病
CD61
血小板/巨核細(xì)胞
急性原始巨核細(xì)胞白血病
CD68
單核/巨噬細(xì)胞
單核/巨噬細(xì)胞腫瘤
CD79a
B細(xì)胞
B淋巴瘤
CD79b
B細(xì)胞
B淋巴瘤
CD117
造血干細(xì)胞
急性髓細(xì)胞白血病
細(xì)胞周期蛋白D1
B細(xì)胞
套細(xì)胞淋巴瘤
DBA-44
B細(xì)胞
多毛細(xì)胞白血病
Ki-67
增殖分?jǐn)?shù)
高度惡性淋巴瘤
PAX/BSAP
B細(xì)胞
霍奇金和非霍奇金淋巴瘤
TdT
前體T/B細(xì)胞
前體T/B細(xì)胞淋巴瘤/白血病
TRAcp
淋系細(xì)胞
多毛細(xì)胞白血病
ALCL,間變性大細(xì)胞淋巴瘤;TdT,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶;TRAcp,抗酒石酸酸性磷酸酶