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淋巴細(xì)胞由于表面特異性抗原的差異可分為四大類（表10-3），這些不同抗原表現(xiàn)型的亞群執(zhí)行不同的機(jī)能。而且某些疾病會(huì)選擇性地?fù)p傷某些亞群而造成亞群之間的比例失調(diào)。根據(jù)FCM雙熒光分析的結(jié)果，現(xiàn)將不同的抗原和不同的機(jī)能的淋巴細(xì)胞亞群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴細(xì)胞亞群的表面抗原

＋：表現(xiàn)的抗原；－：未表現(xiàn)的抗原；＋／－：主要亞群有表現(xiàn)的抗原；－／＋：抗原僅表現(xiàn)于少數(shù)亞群。

表10－14　淋巴細(xì)胞機(jī)能性亞群

外周血白細(xì)胞的機(jī)能，特別是淋巴細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體的免疫機(jī)能。近幾年來(lái)，用FCM來(lái)測(cè)定某些疾病的淋巴細(xì)胞及其亞群已成為重要的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)，如對(duì)骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的診斷和對(duì)免疫缺陷病的估價(jià)等。測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群的主要依據(jù)是在于淋巴細(xì)胞表面不同的抗原表現(xiàn)型，而這些表現(xiàn)型又依賴于相應(yīng)的單克隆抗體而被識(shí)別。所以，特異性很高的單克隆抗體結(jié)合先進(jìn)的FCM，已為臨床提供了不少非常有用而重要的資料，但被FCM所分析的淋巴細(xì)胞的整個(gè)臨床意義尚未完全認(rèn)識(shí)清楚。隨著更多確定淋巴細(xì)胞表現(xiàn)型的試劑的應(yīng)用，F(xiàn)CM對(duì)診斷和治療計(jì)劃的擬定以及預(yù)后的估計(jì)將會(huì)表現(xiàn)出更重要的實(shí)用意義。

1．T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定如前所述，在使用FCM分析時(shí)，先用0^。散射和90^。光散射雙指標(biāo)將白細(xì)胞分為三群：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。在二維點(diǎn)圖上劃出淋巴細(xì)胞群范圍后，設(shè)立GFL的RFL單指標(biāo)的直方圖。命電子計(jì)算機(jī)僅計(jì)數(shù)所輸入的淋巴細(xì)胞，即劃線框出的那部分細(xì)胞。一般計(jì)數(shù)輸入的細(xì)胞可設(shè)1000～5000個(gè)。直方圖的分析可顯示陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。應(yīng)用輸入細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，就能得到陽(yáng)性細(xì)胞的絕對(duì)值，即每立方毫米血液中的絕對(duì)值。有時(shí)T淋巴細(xì)胞某亞群的絕對(duì)值比百分率更為重要，因?yàn)樗梢员砻鱐細(xì)胞某亞群的增高和減少。當(dāng)然，淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)也是一個(gè)重要數(shù)據(jù)，應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確測(cè)出。

CD₄/CD₈細(xì)胞的比值，有時(shí)也用于反映病人淋巴系統(tǒng)的機(jī)能狀態(tài)。不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已把CD₄/CD₈的值作為常規(guī)血檢查的項(xiàng)目。在國(guó)際上，淋巴細(xì)胞亞群以及CD₄/CD₈并未建立統(tǒng)一數(shù)值，各實(shí)驗(yàn)室均需建立自己的標(biāo)準(zhǔn)。平均值一般為1.73～2.00。

一般而言，影響淋巴細(xì)胞亞群的因素較多，如年齡、性別、種族、以及外周圍環(huán)境如季節(jié)　、藥品等的影響。T細(xì)胞的絕對(duì)值在兒童略高于成人。嬰兒CD₄細(xì)胞的百分率較成年人高；老年人的CD₈略低。正常人在一晝夜內(nèi)也有周期性的波動(dòng)：上午CD₄略低，下午4時(shí)之后開始增加，直至次晨，平均波動(dòng)為15%～20%。盡管正常情況下淋巴細(xì)胞亞群有所變動(dòng)，但仍屬正常范圍。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴細(xì)胞腫瘤，其淋巴細(xì)胞亞群及其比值測(cè)量結(jié)果均可能偏離正常范圍。

有工作報(bào)道，傳統(tǒng)的T輔助誘導(dǎo)細(xì)胞（CD₄⁺）具有抑制機(jī)能，而在T抑制細(xì)胞毒細(xì)胞（CD₄⁺）中，有些又具有協(xié)助的功能。因此，對(duì)原來(lái)設(shè)想的CD₄、CD₈的機(jī)能分群有所混淆。預(yù)計(jì)會(huì)有新的單克隆抗體再?gòu)腃D₄和CD₈的細(xì)胞中分出。不過(guò)就目前看來(lái)，不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已用CD₄/CD₈比值結(jié)合淋巴細(xì)胞絕對(duì)值對(duì)多種疾病的診斷、治療和預(yù)后的估計(jì)提供了不少有價(jià)值的資料。

2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一種由人類T淋巴細(xì)胞病毒（HLTV--III）感染而造成的疾病。這種病毒主要侵襲CD₄⁺T細(xì)胞，而導(dǎo)致CD₄淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈淋巴細(xì)胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多發(fā)生在同性戀性行為活躍的男性，這可能與多次重復(fù)感染HLTV-III有關(guān)。對(duì)異性性行為活躍的人來(lái)講，對(duì)HLTV—IIi 感染的機(jī)會(huì)也不容忽視。另一種感染的途徑是HLTV血清陽(yáng)性的獻(xiàn)血者對(duì)受血者的感染。有部分人血液中T淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反應(yīng)不一定就是陽(yáng)性。有些人CD₄減少不明顯，但CD₈有所增加，也會(huì)導(dǎo)致CD₄/CD₈的的比值下降。

對(duì)可疑為艾滋病及血清檢驗(yàn)為陽(yáng)性的人，T細(xì)胞亞群是分析了解免疫系統(tǒng)被病毒破壞程度的標(biāo)志。初診時(shí)，CD₄細(xì)胞越少，CD₄/CD₈值越低者，預(yù)后越差。所以經(jīng)治療后恢復(fù)的指標(biāo)則是CD₄細(xì)胞數(shù)增加，CD₄/CD₈比值升高。用熒光標(biāo)記雙染色的FCM分析的結(jié)果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改變外，同時(shí)還可以表現(xiàn)出OKT₁₀陽(yáng)性細(xì)胞增多（圖10-15）。病人表現(xiàn)為CD₈和OKT₁₀同時(shí)增加時(shí)，預(yù)后比OKT₁₀陽(yáng)性細(xì)胞低的病情嚴(yán)重。

圖10-15　健康人艾滋病人淋巴細(xì)胞表面抗原的比較

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺細(xì)胞均減少，而Leu₂⁺、Leu₈^-細(xì)胞相應(yīng)增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺與Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺細(xì)胞明顯增加

3．白血病和淋巴瘤的表現(xiàn)型　近年來(lái)，為了弄清這些腫瘤的病理組織形態(tài)、影響治療效果的原因與免疫狀態(tài)的相互關(guān)系，對(duì)于不同類型的白血病和淋巴瘤作為廣泛的細(xì)胞表面表現(xiàn)型的研究。

在診斷方面，F(xiàn)CM與單克隆抗體結(jié)合，可以弄清這些腫瘤的免疫起源，特別是分清B細(xì)胞性、T細(xì)胞性或骨髓性腫瘤。同時(shí)，還可以證實(shí)一些與細(xì)胞起源相關(guān)的抗原，如普通急性淋巴細(xì)胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀）。另外，可以用適當(dāng)?shù)脑噭姆磻?yīng)免疫過(guò)程中來(lái)證實(shí)單克隆的腫瘤細(xì)胞的增殖。

大部分淋巴系統(tǒng)腫瘤均起源于B細(xì)胞。而B細(xì)胞腫瘤常用抗免疫球蛋白的抗體來(lái)證實(shí)。由于前B細(xì)胞與漿細(xì)胞表面均無(wú)免疫蛋白，所以用檢測(cè)免疫球蛋白的辦法就只能證實(shí)B細(xì)胞發(fā)育中間時(shí)期的腫瘤。目前，已有一系列的B細(xì)胞表面抗原被發(fā)現(xiàn)，而可以證實(shí)B細(xì)胞個(gè)體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期的腫瘤。

對(duì)B細(xì)胞腫瘤最有價(jià)值的抗原是CALLA。這種抗原僅存在于B細(xì)胞正常以育期的前B細(xì)胞、早期B細(xì)胞以及80%～90%的急性淋巴細(xì)胞性白血病。因此，抗CALLA抗體可以區(qū)別淋巴細(xì)胞性和髓性白血病。用抗CALLA結(jié)合其它一些成熟B細(xì)胞的單克隆抗體，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1）將能證實(shí)大部分B細(xì)胞來(lái)源的腫瘤。圖10-16給出了B細(xì)胞分化的各個(gè)時(shí)期細(xì)胞膜的表現(xiàn)型。來(lái)源于B細(xì)胞的腫瘤和正常B細(xì)胞的表現(xiàn)型相似，也就是說(shuō)，B細(xì)胞前身、成熟B細(xì)胞及最后分化為分泌B細(xì)胞—漿細(xì)胞。

圖10-16　B細(xì)胞分化各時(shí)期的細(xì)胞膜表現(xiàn)型

由于T淋巴細(xì)胞來(lái)源的腫瘤浸潤(rùn)性較強(qiáng)，預(yù)后較差，并需要多種治療。T細(xì)胞腫瘤的表現(xiàn)型千變?nèi)f化，但大部分均表現(xiàn)T細(xì)胞抗原CD₇（Leu₉,3A）或其它T細(xì)胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁）。這些抗原與腫瘤的細(xì)胞成熟時(shí)間有關(guān)，因而有助于擬定治療方案。從FCM分析的結(jié)果表明，非成熟的T細(xì)胞腫瘤常表現(xiàn)非成熟的T細(xì)胞抗原，如CD₁和t₁₀。而成熟的T 細(xì)胞腫瘤則僅表現(xiàn)成熟T細(xì)胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有時(shí)也可表現(xiàn)CD₂、CD₈，但不會(huì)出現(xiàn)在同一個(gè)細(xì)胞上面。

由于腫瘤細(xì)胞的多種來(lái)源，很難避免在腫瘤標(biāo)本中混雜正常細(xì)胞，這給FCM的分析帶來(lái)技術(shù)上的困難。如殘留的紅細(xì)胞在FCM分析時(shí)，落入淋巴細(xì)胞框定的范圍內(nèi)而造成淋巴細(xì)胞各種亞群百分率下降。所以在制備標(biāo)本時(shí)，應(yīng)盡量想法去除紅細(xì)胞。另一種污染是正常細(xì)胞存在于腫瘤細(xì)胞之間，這是一個(gè)很頭痛的問(wèn)題。例如骨髓常被外周血污染，反應(yīng)性的正常淋巴細(xì)胞滲入到腫瘤組織中等，因此估計(jì)污染程度對(duì)解釋FCM分析的資料有一定的意義。因?yàn)樵贔CM分析時(shí)，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可能由于不同的體積和密度而被分開，根據(jù)對(duì)污染的估計(jì)，仔細(xì)分析圖像就能得到比較正確的結(jié)果。

4．FCM對(duì)正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤分析FCM對(duì)正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤的分析在免疫學(xué)研究和臨床診斷上有著重要的實(shí)用價(jià)值，B細(xì)胞的某些特征必須使用FCM來(lái)分析，但是這在FCM技術(shù)方法中仍存在著一些需要解決的問(wèn)題。

（1）B細(xì)胞的標(biāo)記：B細(xì)胞膜表現(xiàn)免疫球蛋白（SIg）存在于所有成熟B細(xì)胞。最早的B細(xì)胞前身，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有免疫球蛋白M（IgM），但不存在于細(xì)胞膜表面。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IgM的證實(shí)以及同時(shí)測(cè)定細(xì)胞表面的SIg，對(duì)FCM是很困難的，當(dāng)然今后可能會(huì)用雙染法來(lái)解決這樣的難題。大部分成熟B細(xì)胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，當(dāng)然這也可能是因?yàn)椴煌膩喨旱木壒?。但僅以Ig的重鏈來(lái)分類B細(xì)胞是不可靠的，因?yàn)锽細(xì)胞可以從膜表面的IgM逐漸轉(zhuǎn)變成IgG，因而從重鏈著手無(wú)法把B細(xì)胞分類。大部分B細(xì)胞腫瘤也表現(xiàn)出帶有SIgM和SigD。隨著B細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成漿細(xì)胞，膜表面Ig 逐漸喪失，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)又出現(xiàn)大量的免疫球蛋白。

與重鏈相反，B細(xì)胞的整個(gè)發(fā)生期只有一種k或者λ輕鏈，B細(xì)胞腫瘤克隆僅表現(xiàn)一種輕鏈，因此通過(guò)在FCM上顯示的不平衡的輕鏈表現(xiàn)可以確定B細(xì)胞腫瘤。測(cè)定方法見（3）。

用SIg的最大缺點(diǎn)是它的“嗜細(xì)胞性”，因?yàn)檎細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）、激活T細(xì)胞以及所有巨噬細(xì)胞均有Fc段受體，因而可以不同程度地與抗SIg單克隆抗體的Fc段結(jié)合而產(chǎn)生非特異性的結(jié)果，因此選擇抗體時(shí)，應(yīng)使用已被胃蛋白酶消化過(guò)的、Fc段也被去除的、僅留下來(lái)的F（ab’）₂。

（2）FCM測(cè)定B細(xì)胞的臨床指證：

①免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或獲得性的。低丙種球蛋白白血癥和無(wú)丙種球蛋白白血癥常伴有免疫球蛋白分泌的紊亂，因此有必要分析B細(xì)胞。

②淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病，80%來(lái)源于B細(xì)胞。因而一旦懷疑為淋巴瘤，就應(yīng)仔細(xì)用FCM對(duì)B細(xì)胞的表現(xiàn)型進(jìn)行分析，可以分析血、骨髓、以及活檢淋巴結(jié)等。首先確定腫瘤細(xì)胞的來(lái)源：B細(xì)胞性（CD₂₀⁺，SIg⁺）或T細(xì)胞性（CD₃⁺）。也有可能某些淋巴病來(lái)源于單核細(xì)胞（CD₁₁⁺）成裸細(xì)胞而表現(xiàn)出非T非B。一旦確立為B細(xì)胞來(lái)源后，就應(yīng)更進(jìn)一步分析克隆增殖的性質(zhì)：?jiǎn)慰寺?、少克隆、或是多克降珠。單克隆性的增殖往往是腫瘤的標(biāo)志?？梢杂肧Ig的輕鏈和重鏈分別加以測(cè)試，往往輕鏈比重鏈更有價(jià)值。在不久的將來(lái)，或許可以直接用免疫球蛋白的基本加以鑒別。

對(duì)B細(xì)胞亞群的確定，目前并未定論，但某些B細(xì)胞被CD₅（T₁，OKT₁）染色。正常B細(xì)胞中這些細(xì)胞較少，而多見于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷時(shí)期。在B細(xì)胞的腫瘤病人中，10%的也可以出現(xiàn)CD₂₀（B₁）陰性反應(yīng)，這是B細(xì)胞成熟而將分化為漿細(xì)胞的標(biāo)志。在異常B細(xì)胞上，往往有一些B細(xì)胞的標(biāo)記缺失或其它表現(xiàn)型出現(xiàn)，因而對(duì)異常B細(xì)胞的FCM的分析尤為重要。圖10-17顯示CD₁₉—FITc （B細(xì)胞）和CD₅-PE（T細(xì)胞）雙染色的假三維圖像分析。X軸為綠色熒光的Leu₁₂(B細(xì)胞)，Y軸為紅色熒光的PE—Leu₁(T細(xì)胞)。從圖中可見，有較多的細(xì)胞表現(xiàn)出Leu₁₂⁺tLeu₁⁺,陰性區(qū)內(nèi)為NK細(xì)胞和紅細(xì)胞等。

圖10-17　異常B細(xì)胞雙染色的假三維圖

（3）k-λ測(cè)定B細(xì)胞克?。簁、λ測(cè)定法是一種從正常B細(xì)胞中測(cè)定少量B細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的方法。其基本原理是：若有B細(xì)胞克隆存在，將改變某一種輕鏈（k或λ）的熒光強(qiáng)度的分布。若輕鏈為k的B細(xì)胞生長(zhǎng)，則抗k的抗體能測(cè)試出這種變化，而抗λ的抗體的測(cè)試沒(méi)有任何改變。正常情況下，B細(xì)胞的k和λ的熒光強(qiáng)度分布是一致的（見圖10-18）。

圖10-18　k-λ克隆的測(cè)定

正常情況，B細(xì)胞輕鏈分布圖像，一致κ和λ的波形沒(méi)有區(qū)別。但在異常時(shí)，若有單克隆生長(zhǎng)，κ鏈有分布則與λ不一致，在總和的曲線形態(tài)上也會(huì)產(chǎn)生差異。

在實(shí)際應(yīng)用中，血液、體液、組織細(xì)胞的懸浮液效果均較好，而對(duì)于骨髓，大量細(xì)胞的非特異性標(biāo)記會(huì)影響測(cè)定的結(jié)果。這里面必須強(qiáng)調(diào)，正常B細(xì)胞中的克隆細(xì)胞生長(zhǎng)并不意味著它們必然是腫瘤細(xì)胞，還必須結(jié)合其它指標(biāo)再做結(jié)論。不過(guò)這種方法對(duì)確定腫瘤細(xì)胞的存在、細(xì)胞發(fā)育階段、以及經(jīng)治療后病情控制的狀況等，都可以提供一些有用的資料。

以上僅限于從外周血的白細(xì)胞分析這一側(cè)面介紹了FCM的某些疾病中的臨床應(yīng)用。其實(shí)，它也僅只是問(wèn)題的一個(gè)部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由紅系、巨核系、粒系和巨噬細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞成株單元組成的成株細(xì)胞中有所表現(xiàn)。CD₃₄⁺細(xì)胞在人的骨髓細(xì)胞中約占1～4%，而在外周血中卻探測(cè)不到。又如，NK細(xì)胞近來(lái)被認(rèn)為可能和人類的某些疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，對(duì)NK細(xì)胞的測(cè)量可以作為免疫治療的免疫監(jiān)測(cè)的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的釋放來(lái)檢測(cè)NK敏感的靶細(xì)胞的毒理學(xué)活性從而評(píng)估NK的功能的，而采用熒光探針CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate）標(biāo)記則可用FCM技術(shù)更為安全可靠地進(jìn)行測(cè)定。有報(bào)告指出，健康男人的數(shù)值為（67.1±22.7%）%，健康女人為（63.9±20.0%）；患有婦科癌腫病人則為（38.5±23.1）%,明顯偏低。這些工作表明，F(xiàn)CM的技術(shù)從免疫組織化學(xué)角度還會(huì)有所發(fā)展。在第二節(jié)　我們?cè)?jiǎn)單介紹了流式細(xì)胞分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程中應(yīng)用的一些技術(shù)途徑，這也可以啟發(fā)我們借助于FCM來(lái)提高免疫組織化學(xué)的分析能力。可以預(yù)見，F(xiàn)CM一定會(huì)成為免疫組織化學(xué)的一項(xiàng)重要的技術(shù)工具，并將在醫(yī)學(xué)科研和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用。

附【美國(guó)Becton –Dickinson 公司可提供的FCM標(biāo)準(zhǔn)】熒光微球（Fluorescent beads）；雞紅細(xì)胞核（Chicken erythrocyte nu－clei）和小牛胸腺細(xì)胞核（Calf thymocyte nuclei），用于DNA測(cè)量的質(zhì)量控制；單克隆抗體試劑；以及用于免疫表型（immunopheno－typing）和其它臨床應(yīng)用的藥盒。