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在所有活生物體中，作為表觀遺傳學(xué)的第三層，已鑒定出150多種RNA修飾，包括5-甲基胞嘧啶（m 5 C），N6-甲基腺苷（m 6 A）和N1-甲基腺苷（m 1 A）。在這些修飾中，廣泛存在于mRNA，lncRNA和miRNA中的m 6 A RNA甲基化被認為是真核細胞內(nèi)部修飾的最突出和最豐富的形式。越來越多的證據(jù)表明，m6A調(diào)節(jié)劑的表達失調(diào)和基因變化與多種生物過程的紊亂相關(guān)，包括細胞死亡和增殖失調(diào)、發(fā)育缺陷、腫瘤惡性進展、自我更新能力受損、免疫調(diào)節(jié)異常等。

近來，一些研究揭示了TME浸潤免疫細胞與m6A修飾之間的特殊相關(guān)性，這不能通過RNA降解機制來解釋。但由于技術(shù)的限制，上述研究必然只局限于一兩個m6A調(diào)節(jié)因子和細胞類型，而抗腫瘤作用的特點是眾多腫瘤抑制因子高度協(xié)調(diào)地相互作用。因此，全面認識多個m6A調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)的TME細胞浸潤特征，將有助于提高我們對TME免疫調(diào)節(jié)的認識。

1）從TCGA中獲取TCGA-STAD隊列，使用R包TCGAbiolinks將FPKM值轉(zhuǎn)換為TPM值。

2）GEO數(shù)據(jù)庫中獲取GSE15459，GSE34942，GSE57303，GSE62254 （ACRG），GSE84437，GSE26253數(shù)據(jù)的CEL文件。采用了強大的多陣列平均方法以及affy和simpleaffy軟件包來執(zhí)行背景調(diào)整和分位數(shù)歸一化。

3）從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得體細胞突變數(shù)據(jù)。

4）ACRG隊列的GSE62717數(shù)據(jù)集進行拷貝數(shù)變異（CNV）分析。

流程圖

在433個樣本中，有101個樣本發(fā)生了m6A調(diào)節(jié)劑的突變，頻率為23.33%。ZC3H13表現(xiàn)出最高的突變頻率，其次是KIAA1429（圖1B）。21個調(diào)控因子普遍存在CNV改變，且大多集中在拷貝數(shù)的擴增上（圖1C）。m6A調(diào)節(jié)子的CNV改變在染色體上的位置如圖1D所示。根據(jù)這21個m6A調(diào)節(jié)子的表達情況，我們完全可以將GC樣本與正常樣本區(qū)分開來（圖1E）。與正常胃組織相比，CNV擴增的m6A調(diào)控因子在GC組織中的表達量明顯較高，反之亦然（圖1C和F）。

圖1 胃癌中m 6 A調(diào)節(jié)子的遺傳和表達變異情況

將5個具有可用OS數(shù)據(jù)和臨床信息的GEO數(shù)據(jù)集（GSE15459、GSE34942、GSE57303、GSE62254（ACRG）和GSE84437）納入一個metacohort。單變量Cox回歸模型揭示了21個m6A調(diào)節(jié)劑在胃癌患者中的預(yù)后價值。用m6A調(diào)節(jié)器網(wǎng)絡(luò)描繪了GC患者m6A調(diào)節(jié)器相互作用、調(diào)節(jié)器連接及其預(yù)后意義的綜合景觀（圖2A）。

作者發(fā)現(xiàn)，writers基因表達量高的腫瘤是否表現(xiàn)出低的erasers基因表達量，實際上取決于不同的writers和erasers基因（圖S2A-S2H）?？紤]到writers基因ZC3H13的突變頻率相對較高，我們分析了ZC3H13-突變體與野生型之間erasers基因的表達差異。其中，與野生型腫瘤相比，ALKBH5在ZC3H13-突變體腫瘤中顯著上調(diào)，而FTO則顯著下調(diào)（圖S2I）。

圖S2 writers基因表達/突變與橡皮擦基因表達之間的相關(guān)性

根據(jù)21個m6A調(diào)節(jié)器的表達情況，利用無監(jiān)督聚類確定了三種不同的修飾模式，其中模式A為389例，模式B為348例，模式C為322例，將這些模式分別稱為m6Acluster A-C（圖S2J）。三種主要m6A修飾亞型的預(yù)后分析顯示，m6Acluster-B修飾模式的生存優(yōu)勢尤為突出（圖2B）。

為了探索這些不同的m6A修飾模式之間的生物學(xué)行為，作者進行了GSVA富集分析。如圖2C所示，m6Acluster-A明顯富集于基質(zhì)和致癌激活途徑。m6Acluster-B呈現(xiàn)出與免疫完全激活相關(guān)的富集途徑。而m6Acluster-C則突出地與免疫抑制生物過程有關(guān)（圖2D）。

隨后對TME細胞浸潤的分析表明，m6Acluster-A在先天性免疫細胞浸潤中非常豐富，包括自然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、MDSC、漿細胞樹突狀細胞等（圖3A）。然而，具有這種m6A修飾模式的患者并沒有表現(xiàn)出匹配的生存優(yōu)勢（圖2B）。

根據(jù)GSVA分析結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)三種m6A修飾模式具有明顯不同的TME細胞浸潤特征。A群被劃分為免疫排除型，以先天性免疫細胞浸潤和基質(zhì)激活為特征；B群被劃分為免疫炎癥型，以適應(yīng)性免疫細胞浸潤和免疫激活為特征；C群被劃分為免疫荒漠型，以抑制免疫為特征（圖2C-D和3A-B）。

利用CIBERSORT方法，比較三種m6A修飾模式中免疫細胞的成分差異，發(fā)現(xiàn)三種m6A修飾模式對TME細胞類型的組成沒有顯著差異，這說明m6A甲基化修飾并沒有改變腫瘤的TME浸潤-細胞類型（圖S2K）。

圖2 m6A甲基化修飾的模式及每種模式的生物學(xué)特征

使用spearman相關(guān)分析檢查了每個TME浸潤細胞類型和每個m6A調(diào)節(jié)器之間的具體相關(guān)性。作者重點研究了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)因子KIAA1429。發(fā)現(xiàn)KIAA1429介導(dǎo)的m6A甲基化修飾可能促進TME DCs的活化，從而增強瘤內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

為了進一步探索這些m6A修飾表型在不同臨床性狀和生物學(xué)行為中的特點，作者將注意力固定在ACRG隊列上（n=300）。無監(jiān)督聚類發(fā)現(xiàn)了ACRG隊列中三種完全不同的m6A修飾模式，三種不同的m6A修飾模式在m6A轉(zhuǎn)錄譜上存在顯著的區(qū)別（圖3C-D）。大部分EMT亞型的患者都聚集在m6Acluster A中，幾乎沒有EMT亞型在m6Acluster B中，這再次證實了m6Acluster A與基質(zhì)激活顯著相關(guān)，m6Aclustre B與免疫激活相關(guān)（圖3E）。單因素方差分析檢驗也證實了三種關(guān)鍵m6A修飾模式對m6A調(diào)節(jié)器表達的顯著差異。

圖3 在不同的m6A修飾模式下的TME細胞浸潤特征和轉(zhuǎn)錄組特征

為了進一步研究每個m6A修飾模式的潛在生物學(xué)行為，作者使用limma包確定了718個m6A表型相關(guān)的DEGs。使用clusterProfiler包對DEGs進行GO富集分析。這些基因的生物過程與m6A修飾和免疫力有明顯的富集，這再次證實了m6A修飾在腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)控中起著不可忽視的作用（圖3F）。

接下來根據(jù)得到的718個m6A表型相關(guān)基因進行了無監(jiān)督聚類分析，無監(jiān)督聚類算法也揭示了三種不同的m6A修飾基因組表型，我們將這三個聚類分別命名為m6A基因簇A-C（圖4A）。三個不同的基因簇具有不同的特征基因。三百名胃癌患者中，有八十八名患者聚集在基因簇A中，這被證明與較好的預(yù)后有關(guān)。而基因簇C的患者（105例）經(jīng)歷了預(yù)后較差的結(jié)果。在基因簇B中觀察到了中等預(yù)后，有107名患者聚在一起（圖4B）。在三個m6A基因簇中，觀察到m6A調(diào)節(jié)因子表達的突出差異，這與m6A甲基化修飾模式的預(yù)期結(jié)果一致（圖4C）。

圖4 構(gòu)建m6A簽名

考慮到m6A修飾的個體異質(zhì)性和復(fù)雜性，基于這些表型相關(guān)基因，作者構(gòu)建了一套評分系統(tǒng)，對胃癌患者個體的m6A修飾模式進行量化，稱之為m6Ascore。采用?；鶊D將個體患者的屬性變化進行可視化描述（圖4D）。還測試了已知簽名與m6Ascore之間的相關(guān)性（圖4E）?；虼谹的中位數(shù)得分最低，而基因簇C的中位數(shù)得分最高（圖4F）。更重要的是，m6A簇A的m6Ascore比其他簇顯著增加，而m6A簇B的中位數(shù)最低（圖4G）。對基質(zhì)相關(guān)通路活性的分析表明，高分與基質(zhì)通路的激活增強顯著相關(guān)（圖4H）。此外，與其他三種ACRG分子亞型相比，EMT亞型患者的m6Ascore也是最低的（圖5A）。上述結(jié)果提示，低m6Ascore與免疫激活顯著相關(guān)，高m6Ascore與基質(zhì)激活相關(guān)。

為了揭示m6A相關(guān)表型在TME免疫調(diào)節(jié)中的作用，作者研究了3個基因簇的趨化因子和細胞因子的表達特征。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因簇C中與TGFb/EMT通路相關(guān)的mRNA明顯上調(diào)，證明該簇被認為是基質(zhì)激活組。而基因簇A中免疫激活轉(zhuǎn)錄相關(guān)mRNA的表達量較高（圖S5F-S5H）。為了更好地描繪m6A特征基因的功能，我們考察了胃癌患者的已知特征基因（圖S5E）。結(jié)果也證實，基因簇C以基質(zhì)激活和促癌狀態(tài)為特征，基因簇A與免疫激活狀態(tài)顯著相關(guān)（圖S5E-S5H）。

圖S5 細胞因子轉(zhuǎn)錄組、趨化因子轉(zhuǎn)錄組及不同基因簇中已知標(biāo)志的特點

接下來，進一步確定m6Ascore在預(yù)測患者結(jié)局方面的價值。以survminer軟件包確定的截止值0.0291，將患者分為低或高m6Ascore組。低m6Ascore患者表現(xiàn)出突出的生存獲益（圖5B）。多變量Cox回歸模型分析，包括患者的年齡、性別、TNM狀態(tài)、組織學(xué)類型、MSI狀態(tài)、TP53狀態(tài)和ACRG分子亞型等因素，證實m6Ascore是評價患者結(jié)果的穩(wěn)健和獨立的預(yù)后生物標(biāo)志物。作者特別研究了m6Ascore特征預(yù)測胃癌患者輔助化療療效的能力，發(fā)現(xiàn)低m6Ascore的患者在同時接受輔助化療的患者中表現(xiàn)出明顯的治療優(yōu)勢（圖5C）。

圖5 TCGA分子亞型中m6A修飾的特點及腫瘤體質(zhì)突變

TCGA項目構(gòu)建了一個全面的胃癌分子景觀，將胃癌分為4個分子亞型，包括基因組穩(wěn)定（GS）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）、EBV感染和染色體不穩(wěn)定（CIN）。較高的m6Ascore明顯集中在GS亞型上，患者的生存率較差，而較低的m6Ascore集中在MSI和EBV感染的亞型上，與較好的生存率有關(guān)（圖5D-E）。高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定亞型的特點是預(yù)后較好，與較低的m6Ascore顯著相關(guān)，而MSI-Low和MSS的m6Ascore較高（圖5F）。在胃癌患者中，m6Ascore特征可能是比MSI和TMB更有效的預(yù)測免疫治療療效的生物標(biāo)志物（圖5E-F）。

作者利用maftools軟件包分析了TCGA-STAD隊列中m6Ascore低和高的體細胞突變的分布差異。如圖5G-H所示，低m6Ascore組比高m6Ascore組呈現(xiàn)出更廣泛的腫瘤突變負擔(dān)。

TMB定量分析證實低m6Ascore腫瘤與高TMB明顯相關(guān)，m6Ascore和TMB也表現(xiàn)出明顯的負相關(guān)。對于TCGA-TSAD中的特定改變基因，突變型與野生型相比，m6Ascore顯著降低（圖5F）。

作者基于兩個免疫治療隊列，研究m6A修飾特征是否可以預(yù)測患者對免疫檢查點阻斷治療的反應(yīng)。在抗PD-L1隊列(IMvigor210)和抗PD-1隊列(GSE78220)中，m6Ascore較低的患者均表現(xiàn)出顯著的臨床獲益，生存期明顯延長(圖6A-G)。證實了低m6Ascore患者與高m6Ascore患者相比，抗PD-1/L1免疫治療具有顯著的治療優(yōu)勢和臨床反應(yīng)。

此外，低m6Ascore的患者PD-L1的表達量明顯偏高，這表明其對抗PD-1/L1免疫治療有潛在的反應(yīng)（圖6H）。高m6Ascore的腫瘤中調(diào)節(jié)性T細胞和TME基質(zhì)被明顯激活，介導(dǎo)了腫瘤的免疫耐受（圖6I）。低m6Ascore和高新抗原負擔(dān)相結(jié)合的患者具有很大的生存優(yōu)勢（圖6J）。上述情況意味著m6A修飾模式的量化是一個潛在的、穩(wěn)健的生物標(biāo)志物，可用于免疫治療的預(yù)后和臨床反應(yīng)評估（圖6K）。較高的m6Ascore與排異和沙漠免疫表型顯著相關(guān)，檢查點抑制劑難以在這些表型中發(fā)揮抗腫瘤作用（圖6L)。

綜上所述，本研究有力地表明，m6A甲基化修飾模式與腫瘤免疫表型和抗PD-1/L1免疫治療的反應(yīng)顯著相關(guān)，建立的m6A修飾特征將有助于預(yù)測抗PD-1/L1免疫治療的反應(yīng)。

圖6 m6A修飾模式在抗PD-1/L1免疫治療中的作用

本研究基于21個 m 6 A調(diào)節(jié)劑，揭示了三個不同的m 6 A甲基化修飾模式，這三種模式具有明顯不同的TME細胞浸潤特性。此外，已證明不同的m 6 A修飾模式之間的mRNA轉(zhuǎn)錄組差異與m 6 A和免疫相關(guān)的生物途徑顯著相關(guān)。這些差異表達的基因被認為是m 6 A相關(guān)的特征基因。考慮到m 6 A修飾的個體異質(zhì)性，作者建立了一套評分系統(tǒng)來評估單個胃癌患者的m 6 A修飾模式-m 6 A基因標(biāo)記，在精確免疫療法治療胃癌中顯示出可預(yù)測的優(yōu)勢。

以上就是本篇文章的大概內(nèi)容啦，這是一篇分析特別全面的文章，僅亞型識別就進行了三次。作者從各個角度深入探討了m 6 A調(diào)節(jié)劑對胃癌的影響，分析十分的全面，怪不得是一篇純生信高分文章。m 6 A現(xiàn)在也是比較熱門的話題，大家可以參考學(xué)習(xí)哦~

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