文獻解讀 | 15+高分文章教你如何只用公共數(shù)據(jù)庫研究RNA修飾

2021.07.30

m6A, m1A，選擇性多聚腺苷酸化（APA）和腺苷到肌苷的RNA編輯（A-I），這四種常見的RNA腺苷修飾，主要是由“writer”酶介導的，構成免疫反應和腫瘤發(fā)生的表觀遺傳調控的關鍵機制。

然而，這些“writer”在腫瘤微環(huán)境(TME)、藥物敏感性、靶向治療和免疫治療中的相互作用和潛在作用仍不清楚。下面我們就來看一篇在結直腸癌里面的研究。

這篇文章是：Cross-talk of four types of RNA modification writers defines tumor microenvironment and pharmacogenomic landscape in colorectal cancer（四種RNA修飾writers的交互定義了結直腸癌的腫瘤微環(huán)境和藥物基因組景觀）。發(fā)表于2021年的Molecular Cancer，IF是15.302，妥妥的高分文章啊。

研究思路

本研究系統(tǒng)地描述了26個RNA修飾“writer”在結直腸癌(CRC)中的mRNA表達和基因改變，并評估了他們在8個數(shù)據(jù)集1697個CRC樣本中的表達模式。使用無監(jiān)督聚類方法將樣本劃分為兩種RNA修飾“writer”的表達模式。

隨后，構建基于負責RNA修飾模式的差異表達基因(DEGs)的RNA修飾“writer”評分(WM_Score)模型，以量化個體腫瘤的RNA修飾相關亞型。

此外，還對WM_Score與TME特征、共識分子亞型(CMSs)、臨床特征、轉錄和轉錄后調控、藥物反應和免疫治療療效進行了關聯(lián)分析。本文的工作流程如下figure1 S所示:

結果證實RNA修飾“writer”的多層改變與CRC患者生存和TME細胞浸潤特征相關。發(fā)現(xiàn)WM_Score-high和-low兩種不同的RNA修飾模式。

WM_Score-high組與較差的患者總生存和抑制免疫細胞的浸潤相關，如M2巨噬細胞、EMT活化和轉移，而WM_Score-low組與生存優(yōu)勢、凋亡和細胞周期信號通路相關。WM_Score與CRC的轉錄和轉錄后事件調控高度相關。

對于抗癌藥物，WM_Score與靶向致癌相關通路如MAPK、EGFR、mTOR信號通路的藥物呈高度負相關(藥物敏感)，與靶向凋亡和細胞周期的藥物呈正相關(耐藥性)。

重要的是，WM_Score與PD-L1阻斷的療效相關，這表明靶向這些“writers”的潛在藥物的開發(fā)有助于免疫治療的臨床效益。（本文的圖文總結如下figure7 S所示：）

結果

1. CRC中四種RNA修飾“writers”的遺傳和轉錄改變

根據(jù)已發(fā)表數(shù)據(jù)，本研究共納入26個RNA修飾“writers”，其中A-I修飾“writers”3個，m6A修飾“writers”7個，m1A修飾“writers”4個，APA修飾“writers”12個。

為了確定癌癥中RNA修飾作者的基因改變，評估了26位writers的非沉默體細胞突變的患病率。在TCGA的LAML、PCPG和UVM三個癌癥隊列中，單個writer突變頻率相對較低，而COAD隊列中“writers”突變頻率相對較高(圖S2A)。

在404個COAD樣本中，119個(29.46%)存在RNA修飾“writers”突變(圖1A)。然而，有這些“writers”突變的CRC患者總生存期比沒有突變的患者短(圖1B)，提示“writer”基因改變可能在CRC中起功能性作用。

接下來，使用hallmark基因集進行了基因集變異分析（GSVA）的富集分析以比較“writers”突變組和非突變組。發(fā)現(xiàn)在突變組中更多的腫瘤標志物相關基因集被富集（圖S2B）。提示writer基因突變可能導致功能改變，影響結腸癌的生存預后。

然后，檢測這些“writers”的體細胞拷貝數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)CSTF1、CPSF1/4、ZC3H13和KIAA1429具有廣泛的拷貝數(shù)變化(CNV)增益(圖1C)。為了確定這些基因變異是否影響了CRC患者中RNA修飾“writer”的表達，比較了配對正常和CRC樣本中調節(jié)因子mRNA的變化，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)“writer”的表達在CRC中顯著增加(圖1D-G)。

與正常結腸組織相比，CRC組織中CNV增加的RNA修飾“writers”(如CSTF1和CPSF1)更頻繁(圖1C和G)，表明CNV可能是“writers” mRNA表達的調節(jié)因子。然而，一些“writer”表達上調，但CNV丟失頻率高。

為探討CNV值與腫瘤組織中mRNA表達的差異，選取8位CNV丟失率超過20%的研究者，根據(jù)CNV值將大腸癌患者分為4組，包括CNV增加、CNV減少和CNV無顯著改變。

然后，比較了這幾組“writer”mRNA的表達情況(圖S2C)。在這些“writer”中，CNV增加的患者比CNV減少的患者表達更高。與正常組織相比，METTL14、ADORB1、CPSF2、PABPN1在CNV減少組中表達顯著下調或無顯著變化。

腫瘤的發(fā)生是一個復雜的過程，CNV的變化不能完全解釋腫瘤與正常組織中“writer”表達的差異。雖然許多“writer”的表達變化可以用CNV來解釋，但CNV是部分而不是唯一調控mRNA表達的因子。DNA甲基化和轉錄因子等其他特征，可以調節(jié)基因表達。

這一分析表明，正常和CRC樣本之間的基因景觀和RNA修飾“writer”的表達具有高度的異質性，RNA修飾“writer”的表達失衡在CRC的發(fā)生和發(fā)展中具有潛在的作用。

2. 與癌癥特征和免疫浸潤相關的RNA修飾“writers”的獨特模式

為了全面了解參與CRC腫瘤發(fā)生的“writers”的表達模式，選擇8個包含臨床信息的數(shù)據(jù)集(GSE41568、GSE39582、GSE13294、GSE14333、GSE18105、GSE20916、GSE21510、GSE37892)中的1695個CRC樣本進行進一步分析。單因素Cox回歸顯示，在GSE39582數(shù)據(jù)集中，26個RNA修飾“writers”中有10個與CRC預后相關(圖S3A)。

為了探究writers之間的關系，計算了26個writers在CRC中的表達的成對相關性，發(fā)現(xiàn)正相關比負相關更頻繁。發(fā)現(xiàn)不僅同一類別中RNA修飾“writers”的表達顯著相關，而且不同類型的修飾“writers”之間也存在顯著相關。

ADARB2、ZC3H13和PABPN1的表達與其他“writers”呈負相關。而TRMT61B、TRMT6、KIAA1429、TRMT10C、CSTF2/3、CPSF4、CLP1的表達呈正相關(圖2A)。因此，“writers”之間的交互可能對單個腫瘤之間產(chǎn)生不同的RNA修飾模式很重要。

接下來，根據(jù)26個RNA修飾“writers”的表達譜，應用共識聚類(Consensus Clustering)對RNA修飾模式定性不同的患者進行分類。經(jīng)過非監(jiān)督聚類，合并數(shù)據(jù)集中的727例CRC患者在Cluster_1中被識別，而其他968例患者在Cluster_2中被識別(圖2B)。

在RNA修飾模式的預后分析中，Cluster_2修飾模式的亞型中顯示出特別顯著的生存優(yōu)勢(圖2C)。為了鑒定這些不同的RNA修飾模式的生物學意義，進行GSVA富集分析。Cluster_1顯著富集于基質和致癌激活通路，提示RNA修飾“writers”可能與腫瘤發(fā)生有關。Cluster_2在與增殖和凋亡相關的通路中富集(圖2C)。

大量研究證實了TME浸潤免疫細胞與RNA修飾之間的關系。因此，本文試圖研究“writers”在TME中的功能作用。為了比較RNA修飾模式之間免疫細胞成分的差異，使用CIBERSORT方法，這是一種使用支持向量回歸來確定腫瘤中免疫細胞類型的反卷積算法。

該方法表明RNA修飾“writers”可能與TME細胞浸潤有很強的相關性(圖S3B)。分析兩種RNA修飾簇在TME細胞浸潤方面的差異。觀察到Cluster_1中M2巨噬細胞、調節(jié)性細胞(Tregs)、T濾泡輔助細胞(Thf細胞)和T γδ細胞浸潤率較高。

在Cluster_2中，活化的樹突狀細胞、自然殺傷細胞和M1巨噬細胞的浸潤增加(圖2E)。總的來說，RNA修飾的Cluster_1在免疫抑制細胞中富集，如M2巨噬細胞和Treg，預示預后不良(圖2D)。M2巨噬細胞在Cluster_1中顯著富集，而M1巨噬細胞在Cluster_2中占優(yōu)勢(圖2E-F)。

同樣，對巨噬細胞標記物的表達分析顯示，M2巨噬細胞標記基因IL1R1、FIZ1、TGFB1、IL10、ARG1在Cluster_1中較Cluster_2中顯著上調，而M1巨噬細胞標記基因IL12A、NOS2、IL23A、IL15RA顯著下調(圖2G)。這表明RNA修飾模式影響了特定免疫細胞類型的浸潤程度，但沒有改變浸潤免疫細胞的類型。