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1. 乳腺癌中m6A調(diào)節(jié)因子的遺傳變異景觀

首先，共鑒定出23個(gè)調(diào)控RNA甲基化的基因，包括8個(gè)writers（METTL14、METTL3、RBM15/RBM15B、CBLL1、WTAP、ZC3H13和VIRMA）、2個(gè)erasers（ALKBH5和FTO）和13個(gè)readers（FMR1、YTHDF1/2/3、HNRNPA2B1、YTHDC1/2、RBMX、HNRNPC、LRPPPRC和IGF2BP1/2/3）。RNA修飾中m6A甲基化的動(dòng)態(tài)過(guò)程和機(jī)制如圖1A所示。接下來(lái)，作者整合體細(xì)胞突變和CNV來(lái)探索BC中23個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子的突變率。m6A調(diào)節(jié)因子的總體突變頻率相對(duì)較低，983個(gè)樣本中只有55個(gè)導(dǎo)致m6A調(diào)節(jié)因子突變（圖1B）。在23個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子中，LRPPRC、YTHDF1、FMR1、WTAP、YTHDC1、YTHDF3和RNPA2B1在BC發(fā)生突變，而其他調(diào)節(jié)因子未發(fā)生突變。此外，發(fā)現(xiàn)23個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子的CNV改變頻率在BC中普遍存在，其中大部分與拷貝數(shù)擴(kuò)增有關(guān)。然而，WTAP、RBM15、ZC3H13、YTHDC2、YTHDF2和RBM15B的CNV缺失頻率較高（圖1C）。染色體上m6A調(diào)節(jié)劑的CNV改變位置如圖1D所示?；谶@23個(gè)m6A甲基化相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，BC樣本可以明顯區(qū)別于正常樣本（圖1E）。然后，作者研究了BC和正常組織中m6A調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)水平，以確定異常表達(dá)是否與BC惡性腫瘤相關(guān)。與正常乳腺組織相比，23個(gè)m6A調(diào)節(jié)劑中有17個(gè)存在差異表達(dá)（圖1C，F(xiàn)）。這些結(jié)果表明，m6A調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)水平在BC和正常組織中具有高度異質(zhì)性，證明了m6A調(diào)節(jié)因子異常表達(dá)模式在BC的發(fā)生和進(jìn)展中的潛在作用。

圖1 BC中m6A調(diào)節(jié)因子的分子特征和表達(dá)變異景觀

2. 由23種調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)的m6A甲基化修飾模式

接下來(lái)，探討了m6A調(diào)節(jié)劑在BC患者中的臨床意義，描述了m6A調(diào)節(jié)劑之間的相互作用及其對(duì)BC預(yù)后的影響（圖2A）。這一結(jié)果表明，一些m6A調(diào)節(jié)因子（如YTHDF1和FTO）與預(yù)后不良有關(guān)。然而，其他調(diào)節(jié)因素（如HNRNPC和IGFBR3）與BC患者的良好預(yù)后相關(guān)。此外，同一功能類別的m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)也呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。然后，作者根據(jù)23個(gè)m6A調(diào)節(jié)劑的表達(dá)水平對(duì)具有不同m6A修飾模式的患者進(jìn)行分類。通過(guò)基于模型的聚類生信分析，確定了三種不同的甲基化修飾模式，包括m6AClusterA中的685例、m6AClusterB中的617例和m6AClusterC中的498例（圖2B）。對(duì)m6A修飾的三種主要亞型的預(yù)后生信分析表明，m6AclusterB修飾模式具有特別顯著的生存優(yōu)勢(shì)（圖2C）。此外，分析了臨床因素與三種不同m6A甲基化模式的基因表達(dá)之間的關(guān)系，并在圖2D中呈現(xiàn)。

圖2 m6A甲基化模式及其生物學(xué)特征

通過(guò)GSVA富集生信分析，作者隨后打算研究這些不同m6A修飾模式中生物過(guò)程的富集。m6AclusterA與免疫抑制和其他生物學(xué)過(guò)程顯著相關(guān)。m6AclusterB在與完全免疫激活相關(guān)的途徑中顯著富集，包括Toll_like_receptor_signaling_pathway、T_cell_receptor_signaling_pathway、B_cell_receptor_signaling_pathway和Cheokine_signaling_pathway。此外，m6AclusterC在致癌激活和基質(zhì)通路中顯示出顯著富集，例如TGF_beta_signaling_pathway、Adherens_junction和ECM_receptor_interaction（圖3A、B）。PCA用于分析三種m6A修飾模式的轉(zhuǎn)錄組譜，顯示不同修飾模式的轉(zhuǎn)錄組譜存在顯著差異（圖3C）。在隨后的TME細(xì)胞浸潤(rùn)生信分析中，發(fā)現(xiàn)m6AclusterC在先天免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中富集，如巨噬細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、和DC（圖3D）。然而，根據(jù)生存生信分析結(jié)果，m6AclusterC的患者并不具備相應(yīng)的生存優(yōu)勢(shì)。

圖3 GSVA富集分析

3. m6A甲基化修飾模式的功能注釋

為了探索不同m6A修飾模式中潛在的生物調(diào)控途徑，作者成功鑒定了3429個(gè)與m6A表型相關(guān)的DEG（差異表達(dá)基因）（圖4A）。clusterProfiler軟件包用于分析DEG的基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）的功能富集。結(jié)果如圖4B-E所示。KEGG生信分析表明，DEG在細(xì)胞周期、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性和mTOR信號(hào)通路中富集（圖4B，C）。對(duì)生物過(guò)程的GO生信分析表明，這些DEG富含DNA復(fù)制、DNA代謝調(diào)節(jié)和組蛋白修飾（圖4D，E）。此外，細(xì)胞成分生信分析表明，DEG在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物和轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物以及轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)中含量豐富。分子功能生信分析表明，DEGs主要位于解旋酶活性和轉(zhuǎn)錄共激活因子活性（圖4D，E）。

圖4 m6A甲基化修飾模式的功能注釋

4. m6A基因特征和功能注釋的構(gòu)建

為了進(jìn)一步了解這種調(diào)節(jié)機(jī)制，作者使用來(lái)自TCGA和GEO轉(zhuǎn)錄組譜的Rlimma包，通過(guò)對(duì)與m6A表型相關(guān)的3429個(gè)基因的無(wú)監(jiān)督聚類生信分析將患者分為不同的基因型。通過(guò)基于模型的聚類生信分析，作者最終確定了三種不同的甲基化修飾模式，包括基因簇A中的685例、基因簇B中的617例和基因簇C中的498例（圖5A）。結(jié)果與m6A修飾模式的簇分組一致，揭示了三種不同的m6A修飾基因組表型，稱為m6A基因簇A、簇B和簇C（圖5B）。這表明這三種不同的m6A甲基化模式確實(shí)存在于BC中。三個(gè)m6A基因簇中m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)存在顯著差異，這與先前m6A甲基化修飾模式的預(yù)期結(jié)果一致（圖5C）。此外，基因簇B的預(yù)后良好，而基因簇C的預(yù)后不良（圖5D）。然而，以上只能基于對(duì)患者人群的分析，并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體患者中m6A的甲基化模式。

圖5 m6A基因特征和功能注釋的構(gòu)建

由于m6A甲基化修飾的個(gè)體差異和復(fù)雜性，作者構(gòu)建了一組可以量化個(gè)體BC的m6A修飾模型，即m6Acore。圖6C顯示了個(gè)體患者屬性的變化。作者使用survminer軟件包計(jì)算出最佳截?cái)嘀?.795803，并根據(jù)m6Acore成功將患者分為高組和低組（圖6A）。這些結(jié)果表明，m6A組得分高的患者具有顯著的生存獲益。然后，分析了m6Acore與生物過(guò)程之間的相關(guān)性，以闡明m6A的遺傳特征（圖6B）。此外，Kruskal-Wallis生信分析顯示m6A基因簇之間的m6Ascore存在顯著差異（圖6D）?；虼谻的中位數(shù)得分最低，而基因簇B的中位數(shù)得分最高，表明m6Ascore低組可能與免疫激活相關(guān)特征密切相關(guān)，而m6Ascore高組可能與基質(zhì)激活相關(guān)特征相關(guān)（圖6D）。m6AclusterB的得分高于m6AclusterA和C，m6AclusterC的m6Acore最低（圖6E）。

圖6 m6A修飾模型

5. 腫瘤體細(xì)胞突變中m6A修飾的特征

然后，作者使用maftools軟件包分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中BC患者高低m6Acore的體細(xì)胞突變分布（圖7A，B）。結(jié)果表明，與低m6Acore隊(duì)列相比，高m6Ascore隊(duì)列中PIK3CA的突變率相對(duì)較高。隨后，腫瘤突變負(fù)荷(TMB)的定量生信分析證實(shí)m6Ascore與TMB顯著負(fù)相關(guān)(圖7C)。m6Acore較低的患者與較高的TMB顯著相關(guān)（圖7D）。同時(shí)，m6Ascore生信分析顯示，低M6Score組的患者死亡比例更高（圖7E），并且存活患者的平均m6Ascore高于死亡患者（圖7F）。患者的生存生信分析表明，TMB低的患者比TMB高的患者具有更顯著的預(yù)后優(yōu)勢(shì)（圖7G）。為了預(yù)測(cè)來(lái)自TCGA的BC樣本的分子亞型，作者探索了低m6Ascore組和高m6Ascore組中basal、her2、luminalA、luminalB和正?；颊叩谋壤?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高m6Ascore組中，luminalA型占很大比例，而在低m6Ascore組中，基底型占很大比例。然后，根據(jù)作者建立的評(píng)分，基礎(chǔ)亞型在這些亞型中顯著表現(xiàn)出最低的m6Ascore，與BC患者的總體預(yù)后一致。

圖 7高?；颊吣[瘤體細(xì)胞突變瀑布圖

6. m6A修飾模式在抗PD-1/L1免疫治療中的作用

臨床上，PD-L1免疫治療單獨(dú)考慮免疫細(xì)胞的PD-L1表達(dá)，引入免疫細(xì)胞比例評(píng)分（IPS）作為區(qū)分受益者的指標(biāo)。此外，作者還探討了IPS與BC中的m6Acore之間的關(guān)聯(lián)。高m6Ascore組的IPS-PD1、IPS-CTLA4和IPS-PD1/CTLA4評(píng)分顯著增加（圖8A-D）。針對(duì)PD-1和CTLA-4免疫檢查點(diǎn)的抗體的治療益處可能在高m6Ascore組和低m6Acore組之間有所不同。有證據(jù)表明，具有高TMB狀態(tài)的患者對(duì)PD-1/PD-L1免疫療法具有相對(duì)持久的臨床反應(yīng)，上述分析證明m6A修飾模式與TMB和PD-1/PD-L1免疫治療密切相關(guān)。

圖8 m6A在抗PD-1/L1免疫治療中的作用