5.2021最新最全《NCCN》指南（附下載方法）
已確定多種基因改變可影響治療選擇。檢測(cè)肺癌標(biāo)本的這些改變，對(duì)于確定潛在有效的靶向治療以及避免不太可能提供臨床益處的治療非常重要。
01.分子學(xué)檢測(cè)主要因素
· 對(duì)分子結(jié)果的應(yīng)用與解釋至關(guān)重要的分子學(xué)檢測(cè)主要因素包括：
使用適當(dāng)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室，至少有CLIA認(rèn)證
了解所使用的方法以及這些方法的主要局限性
了解通過(guò)特定分析檢測(cè)（和未檢測(cè)）的變化范圍
在檢測(cè)前，了解腫瘤標(biāo)本是否進(jìn)行過(guò)病理學(xué)檢查和腫瘤富集（即顯微解剖、肉眼分離）
檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室接受的樣品類(lèi)型
02.標(biāo)本采集和管理
· 標(biāo)本采集和管理：
雖然腫瘤檢測(cè)已主要集中于使用 FFPE 組織，但越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室接受其他類(lèi)型的標(biāo)本，特別是未通過(guò) FFPE 法處理的細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本。盡管 FDA 批準(zhǔn)的多種伴隨診斷檢測(cè)不包括細(xì)胞塊檢測(cè)，但如果它是唯一的或最好的材料，強(qiáng)烈建議對(duì)這些標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
使用微創(chuàng)技術(shù)獲取標(biāo)本用于 NSCLC 分子檢測(cè)結(jié)果時(shí)，一個(gè)主要局限性是獲得的組織標(biāo)本可能不足以進(jìn)行分子、生物標(biāo)志物以及組織學(xué)檢測(cè)。因此，為了能夠進(jìn)行所有合適的檢測(cè)，支氣管鏡醫(yī)生和介入放射科醫(yī)生應(yīng)獲取足夠的組織。
當(dāng)組織極少時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采取技術(shù)以最大限度地獲得用于分子和輔助檢測(cè)的組織，包括專(zhuān)門(mén)的小活檢組織學(xué)流程、包括用于診斷和預(yù)測(cè)性檢測(cè)的“預(yù)”切片。
04.檢測(cè)方法
下文分別逐一列舉適當(dāng)可行的檢測(cè)方法的指征；但通常考慮使用幾種方法：
? 用于臨床實(shí)驗(yàn)室的二代測(cè)序 (NGS)。單獨(dú) NGS 分析并不能檢出所有類(lèi)型的改變，重要的是熟悉單獨(dú)分析或聯(lián)合分析可識(shí)別的改變類(lèi)型。
? 如果可行，推薦此時(shí)通過(guò)廣泛的基于專(zhuān)家組的方法進(jìn)行檢測(cè)，最常用 NGS。對(duì)于廣泛檢測(cè)無(wú)可識(shí)別的驅(qū)動(dòng)癌基因的患者（尤其是從不吸煙的患者），考慮基于 RNA 的 NGS（如果尚未進(jìn)行），以最大程度檢測(cè)融合事件。
? 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 可高度針對(duì)性地使用（針對(duì)特定突變）。采用該技術(shù)只能針對(duì)特定的改變進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估。
? 桑格測(cè)序要求最大程度的腫瘤富集。未改良的桑格測(cè)序不適合檢測(cè)富集后腫瘤標(biāo)本中腫瘤仍不足 25％ 至 30％ 的突變檢測(cè)，重要的是也不適于檢測(cè)識(shí)別亞克隆事件（如耐藥突變）。如果使用桑格測(cè)序，幾乎總是推薦使用腫瘤富集方法。
? 可采用其他方法，包括上文未列出的復(fù)合方法（即 SNaPshot、MassARRAY）。
? 熒光原位雜交 (FISH) 分析用于拷貝數(shù)、擴(kuò)增以及結(jié)構(gòu)改變?nèi)缁蛑嘏诺仍S多分析檢查。
? IHC 專(zhuān)用于某些特定分析，可作為一個(gè)有用的替代或其他分析的篩選方法。
05.分子學(xué)分析靶點(diǎn)
下述突變/改變通常以非重疊的方式出現(xiàn)，但 NSCLC 中有 1％-3％ 的變異可能同時(shí)存在。
? EGFR 中最常見(jiàn)的突變（外顯子 19 缺失，外顯子 21 p.L858R 點(diǎn)突變）與對(duì)口服 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑 (TKI) 的治療反應(yīng)有關(guān)；最新數(shù)據(jù)表明，對(duì)于無(wú)敏感 EGFR 突變的腫瘤，在任何線的治療方案中均不應(yīng)使用 EGFR TKI。
? 采用診斷性活檢或手術(shù)后切除樣本進(jìn)行 EGFR 突變分子檢測(cè)，以確認(rèn) EGFR 突變結(jié)果可用于 IIB-IIIA 或高風(fēng)險(xiǎn) IB-IIA 期 NSCLC 患者的輔助治療決定。
? 許多不太常見(jiàn)的 EGFR 改變累計(jì)約占 EGFR 突變陽(yáng)性 NSCLC 的 10%（即外顯子 19 插入、p.L861Q、p.G719X、p.S768I），也與對(duì) EGFR TKI 治療反應(yīng)有關(guān)，但研究的患者人數(shù)較少。
? EGFR 外顯子 20 (EGFRex20) 突變是一種異質(zhì)突變組，其中一部分對(duì)靶向治療有反應(yīng)，需要詳細(xì)了解特定的改變。
– EGFR p.T790M 是對(duì)第一代和第二代 EGFR TKI 有反應(yīng)和成為其耐藥機(jī)制的最常見(jiàn)突變。在使用第一代或第二代 TKI 期間出現(xiàn)進(jìn)展且 p.T790M 為主要耐藥機(jī)制的患者中，第三代 TKI 通常有效。若在既往未接受 EGFR TKI 治療的情況下發(fā)現(xiàn) p.T790M，需要進(jìn)行遺傳咨詢(xún)，并可能需要進(jìn)行生殖系基因檢測(cè)。
– 大多數(shù)其他 EGFRex20 改變是一組不同的框內(nèi)重復(fù)或插入突變。
? 這類(lèi)突變通常對(duì) EGFR TKI 治療無(wú)反應(yīng)，但特定情況除外：p.A763_Y764insFQEA 具有 TKI 治療敏感性 p. A763_Y764insLQEA 可能具有 TKI 治療敏感性
? 因此，EGFRex20 插入突變的特定序列非常重要，一些檢測(cè)能在不檢測(cè)序列的情況下識(shí)別 EGFRex20 插入突變的存在。在這種情況下，需要進(jìn)行額外的檢測(cè)，進(jìn)一步明確 EGFRex20 插入序列。
? 隨著 NGS 檢測(cè)使用的增加，發(fā)現(xiàn)的其他 EGFR 突變?cè)絹?lái)越多；但不太可能確定個(gè)體改變的臨床意義。
? 某些臨床病理特征（例如吸煙狀況、種族和組織學(xué)特征）與存在 EGFR 突變有關(guān)；但這些特征不應(yīng)用于選擇需接受檢測(cè)的患者。
? 檢測(cè)方法：實(shí)時(shí) PCR、桑格測(cè)序（理想情況是腫瘤富集配對(duì)）和 NGS 是檢查 EGFR 突變狀態(tài)的最常用方法。
? 盡管已鑒定了多種融合伴侶，但 ALK 最常見(jiàn)的融合伴侶是棘皮類(lèi)微管相關(guān)樣蛋白 4 (EML4)。
? 存在 ALK 重排與對(duì)口服 ALK TKI 治療反應(yīng)相關(guān)。
? 某些臨床病理特征（如吸煙狀況和組織學(xué)特征）與存在 ALK 重排有關(guān)；但這些特征不應(yīng)用于選擇需接受檢測(cè)的患者。
? 檢測(cè)方法：FISH 分離探針?lè)椒ㄊ菑V泛使用的第一種方法。IHC 可作為一個(gè)有效的篩選策略。FDA 批準(zhǔn)的 IHC（ALK [D5F3] CDx 分析）可作為獨(dú)立檢測(cè)使用，無(wú)需 FISH 確認(rèn)。多種 NGS 方法可以檢測(cè) ALK 融合。某些情況下使用靶向?qū)崟r(shí) PCR 分析，盡管其不太可能檢測(cè)與新型伴侶的融合。
? ROS1 有許多融合伴侶，常見(jiàn)的融合伴侶包括：CD74、SLC34A2、CCDC6 和 FIG。
? 存在 ROS1 重排與對(duì)口服 ROS1 TKI 治療反應(yīng)相關(guān)。
? 某些臨床病理特征（如吸煙狀況和組織學(xué)特征）與存在 ROS1 重排有關(guān)；但這些特征不應(yīng)用于選擇需接受檢測(cè)的患者。
? 檢測(cè)方法：可以采用 FISH 分選探針?lè)?；但它可能檢測(cè)不出 FIG-ROS1 變異?？梢圆捎?IHC 方法，但 IHC 對(duì) ROS1 融合的特異性低，因此，ROS1 IHC 作為一個(gè)篩選程序，后續(xù)驗(yàn)證性檢測(cè)是一個(gè)必要的組成部分。多種 NGS 方法可以檢測(cè) ROS1 融合，但基于 DNA 的 NGS 可能無(wú)法檢出 ROS1 融合。某些情況下使用了靶向?qū)崟r(shí) PCR 分析，盡管其不太可能檢測(cè)與新型伴侶的融合。
? BRAF 突變可見(jiàn)于 NSCLC。特定突變的出現(xiàn)導(dǎo)致氨基酸 600 部位改變 (p.V600E)，與對(duì)口服 BRAF 和 MEK 抑制劑聯(lián)合治療敏感相關(guān)。? 值得注意的是，在 NSCLC 中觀察到 BRAF 的其他突變，目前尚不十分清楚這些突變對(duì)治療選擇的影響。
? 檢測(cè)方法：實(shí)時(shí) PCR、桑格測(cè)序（理想情況是腫瘤富集配對(duì)）和 NGS 是檢查 BRAF 突變狀態(tài)的最常用方法。雖然抗 BRAF p.V600 E 特異性單克隆抗體可商購(gòu)，并且一些研究已經(jīng)使用了這種方法，但僅在經(jīng)過(guò)廣泛驗(yàn)證后方可開(kāi)展。
? 與腫瘤無(wú) KRAS 突變的患者相比，存在 KRAS 突變預(yù)示生存差。
? KRAS 突變與對(duì) EGFR TKI 治療反應(yīng)性降低有關(guān)。? 由于可靶向變異的重疊可能性較低，KRAS 中存在已知激活突變可能識(shí)別不太可能因進(jìn)一步分子學(xué)檢測(cè)受益的患者。
? 存在 METex14 跳躍突變與對(duì)口服 MET TKI 治療反應(yīng)相關(guān)。
? 一系列分子改變均可導(dǎo)致 METex14 跳躍突變。
? 檢測(cè)方法：基于 NGS 的檢測(cè)是檢測(cè) METex14 跳躍情況的主要方法，基于 RNA 的 NGS 在檢測(cè)方面有所改善。IHC 無(wú)法用于檢測(cè) METex14 跳躍突變。
? 常見(jiàn)融合伴侶為 KIF5B、NCOA4 和 CCDC6；但還確定了其他許多融合伴侶。? 存在 RET 重排與對(duì)口服 RET TKI 治療反應(yīng)相關(guān)，無(wú)論融合伴侶如何。
? 檢測(cè)方法：可以采用 FISH 分選探針?lè)ǎ坏赡軝z測(cè)不出某些融合。某些情況下使用了靶向?qū)崟r(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR 分析，盡管其不太可能檢測(cè)與新型伴侶的融合?；?NGS 的方法特異性高，對(duì)于融合檢測(cè)，基于 RNA 的 NGS 優(yōu)于基于 DNA 的 NGS。
? NTRK1/2/3 為酪氨酸受體激酶，是 NSCLC 和其他腫瘤類(lèi)型中罕見(jiàn)的重排，導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)和不當(dāng)。
? 已經(jīng)確定了多種融合伴侶。
? 迄今為止，除了缺乏其他驅(qū)動(dòng)改變外，尚未發(fā)現(xiàn)與這些融合相關(guān)的具體臨床病理特征。
? NTRK1/2/3 的點(diǎn)突變通常為非激活，尚未就其與靶向治療關(guān)系進(jìn)行研究。
? 檢測(cè)方法：可以使用多種方法檢測(cè) NTRK1/2/3 基因融合，包括：FISH、IHC、PCR 和 NGS；可能出現(xiàn)假陰性。某些組織中存在基線表達(dá)使 IHC 方法復(fù)雜化。FISH 檢測(cè)可能需要至少 3 組探針才能進(jìn)行全面分析。NGS 檢測(cè)可以檢出廣泛變化?；?DNA 的 NGS 可能不能檢出 NTRK1 和 NTRK3 融合。
· 在無(wú)法在治療開(kāi)始前合力完成所有生物標(biāo)志物完整評(píng)估的情況下，若有病灶可進(jìn)行采樣和檢測(cè)，可考慮在一線治療期間進(jìn)展時(shí)重復(fù)廣泛檢測(cè)或選定生物標(biāo)志物檢測(cè)。
06.靶向治療期間進(jìn)展的檢測(cè)
對(duì)于許多上面列出的分析物，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到治療耐藥的分子機(jī)制。對(duì)接受靶向治療期間發(fā)生活動(dòng)性進(jìn)展的腫瘤樣本進(jìn)行重新檢測(cè)，有助于闡明下一步的合適治療：
? 對(duì)于已經(jīng)接受 EGFR TKI 治療、具有潛在 EGFR 敏感突變患者，合適的檢測(cè)最低限度應(yīng)包括高敏感性 p.T790M 評(píng)估；無(wú) p.T790M 證據(jù)時(shí)，檢測(cè)其他可能耐藥機(jī)制（MET 擴(kuò)增、ERBB2 擴(kuò)增）可用于指導(dǎo)患者接受其他治療。存在 p.T790M 的患者可接受三代 EGFR TKI 治療。– 檢測(cè) EGFR p.T790M 的方法應(yīng)設(shè)計(jì)為分析靈敏度至少有 5% 的等位基因分?jǐn)?shù)。初始敏感突變可作為多種測(cè)定方法的內(nèi)部對(duì)照，以確定是否存在檢測(cè)范圍內(nèi)的 p.T790M 亞克隆事件。
? 對(duì)于已經(jīng)接受 ALK TKI 治療、具有潛在 ALK 重排的患者，尚不清楚識(shí)別特定酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變是否可以確定治療合理的下一步治療，盡管一些初步數(shù)據(jù)表明特定激酶結(jié)構(gòu)域突變可影響下一線治療。
07.PD-L1（程序性死亡配體 1）
· PD-L1（程序性死亡配體 1）：PD-L1 是一種共調(diào)節(jié)分子，可在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)并抑制 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。T 細(xì)胞表達(dá) PD-1（一種負(fù)調(diào)控因子），與包括 PD-L1 (CD274) 或 PD-L2 (CD273) 的配體結(jié)合。在 PD-L1 存在情況下，T 細(xì)胞活性受抑。
檢查點(diǎn)抑制劑抗體可阻斷 PD-1 和 PD-L1 的相互作用，從而改善內(nèi)源性 T 細(xì)胞的抗腫瘤作用。
可使用 IHC 檢測(cè) PD-L1 以確定一線抗 PD-1/PD-L1 最可能有效的疾病。
? 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于 IHC 檢測(cè) PD-L1 表達(dá)的各種抗體克隆，雖然一些呈現(xiàn)相對(duì)等價(jià)，一些則否。
? 對(duì) NSCLC 中 PD-L1 IHC 的解釋通常集中于表達(dá)任何水平膜染色的腫瘤細(xì)胞比例，因此為線性變量；其他腫瘤類(lèi)型的評(píng)分系統(tǒng)可能有所不同。
? 基于腫瘤比例評(píng)分 (TPS)，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)的 PD-L1 輔助診斷方法可指導(dǎo)帕博利珠單抗用于 NSCLC 患者。TPS 是顯示部分或全部膜染色的存活腫瘤細(xì)胞的百分比（任何強(qiáng)度）。
? 陽(yáng)性和陰性檢測(cè)的界定取決于使用的特定抗體和平臺(tái)，其對(duì)每個(gè)檢查點(diǎn)抑制劑治療可能是唯一的。PD-L1 的多種不同檢測(cè)方法的潛力引起了病理學(xué)家和腫瘤學(xué)家的關(guān)注。
? 盡管存在致癌驅(qū)動(dòng)因素的患者 PD-L1 表達(dá)可能升高，但是針對(duì)致癌驅(qū)動(dòng)因素的靶向治療應(yīng)優(yōu)先于免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療。
08.血漿游離細(xì)胞/循環(huán)腫瘤 DNA 檢測(cè)
不應(yīng)使用游離細(xì)胞/循環(huán)腫瘤 DNA 檢測(cè)代替組織學(xué)診斷。
一些實(shí)驗(yàn)室提供外周循環(huán)中核酸的分子學(xué)改變檢測(cè)，最常見(jiàn)的是經(jīng)過(guò)處理的血漿（有時(shí)稱(chēng)為“液體活檢”）。
研究表明，游離細(xì)胞腫瘤 DNA 檢測(cè)通常特異性非常高，但敏感性大幅降低，假陰性率高達(dá) 30％。
游離細(xì)胞腫瘤 DNA 分析的性能特征尚無(wú)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，而且，與基于組織的檢測(cè)相比，沒(méi)有關(guān)于此類(lèi)檢測(cè)推薦性能特征的指南。
游離細(xì)胞腫瘤 DNA 檢測(cè)可以識(shí)別與關(guān)注病變無(wú)關(guān)的改變，如意義未明的克隆性造血 (CHIP)。
在特定的臨床環(huán)境中可以考慮使用游離細(xì)胞/循環(huán)腫瘤 DNA 檢測(cè)，最值得注意的是：
? 如果患者身體狀況不適合進(jìn)行侵入性組織采樣
? 在初始診斷時(shí)，如果在病理學(xué)確認(rèn) NSCLC 診斷后無(wú)足夠材料進(jìn)行分子分析，則僅在計(jì)劃對(duì)所有未發(fā)現(xiàn)致癌驅(qū)動(dòng)基因的患者進(jìn)行后續(xù)基于組織分析的情況下,才使用游離細(xì)胞/循環(huán)腫瘤 DNA 進(jìn)行分析。
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