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1. 間變性淋巴瘤激酶

間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）最初研究是在間變性大細(xì)胞淋巴瘤，但目前ALK基因重排已見于多種上皮性、間皮性、間葉性腫瘤。肺腺癌中約5%具有ALK重排，最常見為EML4-ALK融合，與其他基因的融合相對少見。NSCLC中ALK陽性者多見于年輕的非吸煙患者，組織學(xué)幾乎全部為腺癌，常伴實性結(jié)構(gòu)及印戒樣細(xì)胞。

美國已批準(zhǔn)ALK抑制劑克唑替尼（crizotinib）、艾樂替尼（alectinib）用于一線治療，一線治療耐藥后也有多種新型ALK抑制劑尚可應(yīng)用，因此目前ALK靶向治療已成為ALK重排肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。正是由于ALK靶向治療的臨床效果、以及ALK重排與臨床病理性特征之間的相關(guān)性并不那么完美，因此目前建議對所有進(jìn)展期肺腺癌均應(yīng)進(jìn)行ALK檢測而不必考慮年齡及是否吸煙。

ALK重排可通過FISH斷裂探針、分子學(xué)或測序等進(jìn)行檢測，也可通過免疫組化進(jìn)行檢測。以往用于間變性大細(xì)胞淋巴瘤的ALK抗體用于NSCLC時敏感性不足，新型抗體D5F3、5A4相比FISH檢測來說，敏感性和特異性均≥95%。

圖3. 伴印戒樣細(xì)胞特征的肺腺癌，ALK陽性；該例FISH檢測證實存在ALK重排。

2.  ROS1

ROS1重排最初研究是在膠質(zhì)母細(xì)胞的細(xì)胞系中，肺腺癌中高達(dá)3%的會具有該重排。與ALK重排NSCLC患者相似，ROS1重排者也多為年輕、非吸煙患者，且?guī)缀跞渴窍侔?；其組織學(xué)特點(diǎn)則為實性、黏液樣、乳頭狀，伴印戒樣細(xì)胞或程度不等的砂礫體樣鈣化。臨床治療二者也有相似，克唑替尼對于ROS1重排的NSCLC患者有效。目前該指標(biāo)也和ALK、EGFR一樣成為了進(jìn)展期肺腺癌患者的必查指標(biāo)，而不必考慮年齡等特征。

ROS1重排最常用檢測方案為FISH，但也可通過其他分子學(xué)方法或免疫組化來檢測。所用抗體克隆號為D4D6，相比其他檢測方法來說敏感性可＞95%；不過對于組織固定欠佳的病例免疫組化效果會降低。需要指出的是，免疫組化中因與ROS1融合的基因不同而染色結(jié)果也有所不同，CD74-ROS1融合者呈球狀著色，EZR-ROS1融合者呈膜著色較強(qiáng)的方式。ROS1免疫組化的特異性在不同研究中有所差異，具體取決于其他參數(shù)和評分標(biāo)準(zhǔn)，甚至有研究中ROS1免疫組化陽性病例的數(shù)量是FISH陽性數(shù)量的8倍。目前，免疫組化檢測ROS1用于進(jìn)展期肺腺癌患者的篩查，陽性者需分子檢測或細(xì)胞遺傳學(xué)方法證實。當(dāng)然，免疫組化陰性者目前認(rèn)為可以可靠的排除ROS1重排，因此免疫組化還可用于FISH或分子檢測方法的相互驗證。

圖4. 中分化、乳頭狀結(jié)構(gòu)為主的肺腺癌中，ROS1陽性；該例經(jīng)FISH檢測證實有ROS1重排。

3. PD-1

PD-1/PD-L1通路的免疫檢查點(diǎn)阻斷已成為腫瘤領(lǐng)域的大熱門。2018年已批準(zhǔn)了下述免疫檢查點(diǎn)抑制劑用于進(jìn)展期NSCLC的治療：納武單抗（nivolumab，針對PD-1），帕博利珠單抗（pembrolizumab，針對PD-1），阿特珠單抗（atezolizumab，針對PD-L1），德瓦魯單抗（durvalumab，針對PD-L1）。由于這類藥物可引起免疫相關(guān)副作用，且只有部分患者獲益，因此必須經(jīng)生物標(biāo)志物檢測證實有治療獲益才可應(yīng)用，尤其一線單藥應(yīng)用的情況下。除相關(guān)免疫組化結(jié)果外，其實檢查點(diǎn)抑制治療的效果還與遺傳學(xué)驅(qū)動情況、突變負(fù)荷、是否吸煙、錯配修復(fù)狀態(tài)等情況有關(guān)。

盡管免疫組化檢測PD-L1在預(yù)測免疫治療效果方面仍不完美，但目前已進(jìn)入臨床及常規(guī)工作中。帕博利珠單抗用于進(jìn)展期NSCLC的1期研究中將PD-L1腫瘤比例評分（tumor proportion score，TPS；指PD-L1膜陽性腫瘤細(xì)胞的比例）閾值設(shè)定為≥50%；但也有研究表明某些情況下PD-L1 TPS≥1%即可有獲益。需要指出的是，目前帕博利珠單抗尚未批準(zhǔn)一線用于EGFR突變、或ALK重排腫瘤，因為這類患者對免疫治療無效。

當(dāng)前實際工作中，EGFR野生型且ALK野生型進(jìn)展期NSCLC患者需進(jìn)行PD-L1免疫組化檢測，以確定是否適合一線應(yīng)用帕博麗珠單抗治療，單藥應(yīng)用時TPS閾值需采取≥50%。非鱗的NSCLC聯(lián)合治療情況下則無需進(jìn)行PD-L1檢測。帕博麗珠單抗用于二線治療時，免疫組化檢測PD-L1的TPS閾值為≥1%。納武單抗或阿特珠單抗則無PD-L1免疫組化檢測的具體要求，但一般說來其效果與免疫組化中陽性表達(dá)的程度呈正比。早期可切除的NSCLC中，僅PD-L1免疫組化結(jié)果對于輔助化療來說并無預(yù)后意義、也無預(yù)測意義；但最近的研究表明手術(shù)切除前新輔助應(yīng)用納武單抗的結(jié)果令人鼓舞，這提示早期可切除的NSCLC中PD-L1評估還是有一定價值。

實際工作中免疫組化評估PD-L1還是有一定挑戰(zhàn)性：目前有多家商用平臺，所用評分標(biāo)準(zhǔn)/閾值、抗體、檢測平臺等各不相同；評分的可重復(fù)性在不同組間、以及組內(nèi)觀察者之間也有差異。對帕博麗珠單抗來說，用克隆號為22C3的抗體（Dako公司產(chǎn)品）在安捷倫公司（Agilent Technologies,）的pharmDx平臺檢測；對納武單抗、阿特珠單抗、德瓦魯單抗來說，則分別用克隆號為28-8（Abcam公司產(chǎn)品）、SP142（Ventana公司產(chǎn)品）、SP263（Ventana公司產(chǎn)品）的抗體進(jìn)行檢測。還有些其他克隆的抗體如E1L3N（Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品），雖然可能已有商用產(chǎn)品，但目前尚未用于治療。

對于這些抗體來說，PD-L1免疫組化陽性均僅為膜著色。大部分檢測中均僅評估腫瘤細(xì)胞的PD-L1結(jié)果，但阿特珠單抗用于進(jìn)展期NSCLC時則對腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞均進(jìn)行評估，最佳臨床效果見于腫瘤細(xì)胞評分高（＞50%）、或免疫細(xì)胞評分高（＞10%）者。目前已有多機(jī)構(gòu)研究正在對不同PD-L1抗體、不同檢測平臺、觀察者一致性等問題進(jìn)行評估。當(dāng)然，NSCLC中PD-L1結(jié)果的差異可能還與腫瘤內(nèi)異質(zhì)性有關(guān)。

圖5. 肺低分化鱗狀細(xì)胞癌，腫瘤細(xì)胞PD-L1免疫組化膜陽性，陽性細(xì)胞數(shù)量＞95%。

4.  EGFR

作為NSCLC中位于KRAS之后的第二常見癌基因，EGFR體細(xì)胞性突變在北美及歐洲患者中約占10-20%，且多見于非吸煙者及女性；在東亞人群，EGFR突變則見于約50%的肺腺癌患者。就NSCLC而言，EGFR突變幾乎僅見于腺癌，且組織學(xué)上常為伴貼壁樣、腺泡狀、乳頭狀生長。具有EGFR突變的肺鱗癌其實最大可能是腺鱗癌、而腺癌成分并未取到。

肺癌中EGFR活性突變位于18-21號外顯子的激酶區(qū)，90%以上的突變集中于21號外顯子的L858R、19號外顯子的ELREA模序移碼缺失。具有肺癌家族史、或從不吸煙但卻罹患多發(fā)肺腺癌者也曾報道有EGFR T790M種系突變。進(jìn)展期肺腺癌一線治療中，對EGFR突變治療來說，EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)化療，但EGFR野生型腫瘤則無此效果，因此治療決策前進(jìn)行EGFR評估意義顯著。對于靶向治療后由于EGFR T790M突變而病變進(jìn)展的患者來說，不可逆性EGFR酪氨酸激酶抑制劑奧西替尼（osimertinib）有效。綜合相關(guān)信息，目前建議對所有進(jìn)展期肺腺癌患者均進(jìn)行EGFR檢測，而不必考慮患者年齡、種族及吸煙情況。

就相關(guān)患者的選擇來說，應(yīng)通過測序進(jìn)行EGFR突變檢測。針對EGFR全蛋白的免疫組化并不能預(yù)測患者酪氨酸激酶抑制劑治療的預(yù)后，在治療方案的選擇上也無臨床價值。針對L858R特異性突變的抗體（如Cell Signaling公司克隆號為43B2的產(chǎn)品、Ventana公司克隆號為SP125的產(chǎn)品），以及針對19號外顯子E746-A750缺失的抗體（如Cell Signaling公司克隆號為6B6的產(chǎn)品、Ventana公司克隆號為SP111的產(chǎn)品）已進(jìn)行了以分子檢測為金標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)驗證。這些抗體的臨床表現(xiàn)不一，有研究表明其敏感性僅44%，而特異性為70%。EGFR 20號外顯子插入所致原發(fā)耐藥突變的腫瘤內(nèi)已證實有免疫組化的假陽性。鑒于上述情況，以及可靠且高敏分子檢測方法應(yīng)用的增多，目前并不推薦EGFR突變特異性免疫組化檢測作為治療選擇的手段；同時鑒于EGFR突變特異性免疫組化檢測的陰性預(yù)測值較低，因此對于陰性結(jié)果者應(yīng)通過分子學(xué)方法重新進(jìn)行EGFR突變檢測。

圖6. 肺腺癌，針對EGFR L858R的免疫組化。

Hung YP.Diagnostic and Predictive Immunohistochemistry for Non-Small Cell Lung Carcinomas[J].Advances in anatomic pathology,2018,25(6):374-386.

DOI:10.1097/PAP.0000000000000206