星期三
2020年12月9日
不忘初心，砥礪前行！
非小細胞肺癌指南
分子學檢測和生物標志物分析原則
（NSCL-H）
NSCL-H,1/5
分子學檢測的注意事項、標本要求、檢測方法
英文版
中文版
非小細胞肺癌的分子診斷學檢查
●已確定許多基因的變異會影響治療方案的選擇。檢測肺癌標本的這些基因變異，對于確定潛在有效的靶向治療以及避免不太可能提供臨床獲益的治療是重要的。
●用于選擇靶向治療的一些方法包括預測性免疫組化分析，這與用于確定腫瘤類型和譜系的免疫組化檢查不同。
●對分子學結(jié)果的應用和解讀至關(guān)重要的分子學檢測的主要要素包括：
?在經(jīng)過適當認證的實驗室進行檢測，至少有CLIA認證
?理解所使用的方法學以及這些方法的主要局限性
?理解通過一種特定分析方法可檢測變異的范圍（以及那些未檢測的變異）
?在檢測前，了解腫瘤標本是否進行過病理學檢查和腫瘤富集（即顯微切割、肉眼分離）
?檢測實驗室接受的樣品類型
●標本采集和管理：
?雖然腫瘤檢測已主要集中在使用福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的組織，但是，越來越多的實驗室接受其它類型的標本，尤其是未通過FFPE流程處理的細胞病理學涂片。盡管FDA批準的多種伴隨診斷分析不包括對細胞塊的檢測，但是當它是唯一或最好的材料時，強烈建議對這些樣本類型進行檢測。
?當使用微創(chuàng)技術(shù)獲取的樣本來進行非小細胞肺癌的分子學檢測時，存在的一個主要局限性是：樣本量可能不足夠用于分子、生物標志物以及組織學檢查。因此，為了能夠進行所有適當?shù)臋z測，支氣管鏡操作醫(yī)生和介入放射科醫(yī)生應該獲取足夠的組織。
?當組織極少時，實驗室應有效地利用技術(shù)來最大限度地利用組織進行分子學和輔助檢查，包括小活檢樣本組織學檢查專用協(xié)議、包括用于診斷和預測性檢測的“預”滑動切片。
●檢測方法
?以下分別列出每一種適當可行的檢測方法；然而，通?？紤]聯(lián)合使用幾種方法：
?二代測序（NGS）用于臨床實驗室。單獨NGS分析并不能檢出所有變異類型，熟悉單獨分析或聯(lián)合分析可識別的變異類型是很重要的。
?建議此時在可行的情況下通過基于廣泛組合的方法進行檢測（最常采用NGS）。對于在廣泛組合的檢測中未發(fā)現(xiàn)驅(qū)動癌基因的患者（尤其是從不吸煙者），請考慮行基于RNA的NGS檢測（如果尚未進行）以最大程度地發(fā)現(xiàn)融合事件。
?實時聚合酶鏈反應（PCR）是一種具有高度針對性的檢測方法（針對特定突變）。采用該技術(shù)只能針對那些特定的改變進行檢測評估。
?桑格測序需要最大程度的腫瘤富集。未改良的桑格測序不適合用于富集后腫瘤含量仍不足25%-30%的標本的突變檢測，且重要的是要認識到它不適合用于分析識別亞克隆事件（如耐藥突變）。如果使用桑格測序，幾乎都建議使用腫瘤富集方法。
?可使用的其它方法，包括上面未列出的復合方法，如SNaPshot技術(shù)（美國應用生物公司(ABI)開發(fā),是一種基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱小測序，主要針對中等通量的SNP分型項目）、MassARRAY（核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)]）。
?熒光原位雜交（FISH）分析用于拷貝數(shù)、擴增以及結(jié)構(gòu)改變?nèi)缁蛑嘏诺仍S多分析檢查。
?免疫組化（IHC）專門用于某些特定分析，可作為一個有用的替代或其它分析的篩選方法。
NSCL-H,2/5
EGFR
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●分析的分子靶點
?一般而言，觀察到的下述突變/變異是非重疊的，盡管有1%–3%的非小細胞肺癌可能有并存的變異。
?EGFR（表皮生長因子受體）基因突變：EGFR是一種受體酪氨酸激酶，通常見于上皮細胞表面，經(jīng)常在多種人類惡性腫瘤中過表達。
?最常描述的EGFR突變（19外顯子缺失、21外顯子p.L858R點突變）與對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療起效相關(guān)；最新數(shù)據(jù)表明，沒有EGFR敏感突變的腫瘤在任何線的治療中均不應使用EGFR TKI。
?考慮在診斷性活檢或手術(shù)切除后的樣本上增加針對EGFR突變的分子學檢測，以確保EGFR突變檢測結(jié)果可用于IB期—IIIA期NSCLC患者的輔助治療決策。
?許多較不常見的EGFR變異，累計占EGFR突變NSCLC的～10%（即19外顯子插入、p.L861Q、p.G719X、p.S768I）也與對EGFR TKI治療起效相關(guān)，盡管研究的患者數(shù)較少。
?EGFR外顯子20（EGFRex20）突變是一個混雜組，其中一些對靶向治療有反應，需要詳細了解具體的變異。
—EGFR p.T790M突變是最常觀察到的引起對第一代和第二代EGFR TKI耐藥的一種機制。對于以p.T790M為主要耐藥機制的第一代或第二代TKI藥物治療中疾病進展的患者，第三代TKI通常有效。如果在先前沒有接受過EGFR TKI治療的情況下觀察到p.T790M，則必須進行遺傳咨詢和可能的胚系基因變異檢測。
—其它大多數(shù)EGFRex20變異是框內(nèi)重復或插入突變的一個多元化組。
? 這些變異通常與對EGFR TKI缺乏療效有關(guān)，但以下情況除外：
p.A763_Y764insFQEA與對TKI治療的敏感性有關(guān)
p. A763_Y764insLQEA可能與對TKI治療的敏感性有關(guān)
? 由于這個原因，EGFRex20插入突變的具體序列很重要，一些檢測方法會在不報告具體序列的情況下鑒定是否存在EGFRex20插入。在這種情況下，需要進行其它測試以進一步闡明EGFRex20插入。
?隨著NGS檢測使用的增加，發(fā)現(xiàn)了越來越多的其它EGFR變異；然而，不太可能很好地確認個體變異的臨床意義。
?某些臨床病理特征（如吸煙狀況、種族、組織學）與EGFR突變的存在相關(guān)；然而，這些特征不應用于挑選進行檢測的患者。
?檢測方法：檢測EGFR突變狀態(tài)的方法有實時PCR、桑格測序（理想的是配以腫瘤富集）以及最常用的NGS。
NSCL-H,3/5
ALK、ROS1、BRAF、KRAS
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中文版
?ALK（間變性淋巴瘤激酶）基因重排：ALK是一種受體酪氨酸激酶，可在非小細胞肺癌中重排，導致通過ALK激酶域的信號失調(diào)和失當。
?ALK最常見的融合伴侶是棘皮類微管相關(guān)樣蛋白4（EML4），盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它融合伴侶。
?存在一種ALK重排與對ALK TKI起效相關(guān)。
?某些臨床病理特征（如吸煙狀況和組織學）與ALK重排的存在相關(guān)；然而，這些特征不應用于挑選進行檢測的患者。
?檢測方法：分離FISH探針是第一個被廣泛采用的方法。免疫組化可作為一種有效的篩選策略。FDA批準的IHC（ALK [D5F3] CDx分析）可作為獨立檢測，不需要FISH確認。許多NGS方法可以檢測ALK融合，在某些情況下使用定向?qū)崟rPCR法，雖然不太可能發(fā)現(xiàn)與新的伴侶融合。
?ROS1（ROS原癌基因1）基因重排：ROS1是一種受體酪氨酸激酶，可在非小細胞肺癌中重排，導致通過ROS1激酶域的信號失調(diào)和失當。
?ROS1有許多融合伴侶，常見的融合伴侶包括：CD74、SLC34A2、CCDC6和FIG。
?存在一種ROS1重排與對口服ROS1 TKI起效相關(guān)。
?某些臨床病理特征（如吸煙狀況和組織學）與ROS1重排的存在相關(guān)；然而，這些特征不應用于挑選進行檢測的患者。
?檢測方法：可以采用分離FISH探針法；然而，它可能檢測不出FIG-ROS1變異?？梢圆捎肐HC；然而，免疫組化用于檢測ROS1融合的特異性低，因此如果使用ROS1 IHC作為一種篩查手段，后續(xù)的驗證性檢測是一個必要的組成部分。許多NGS方法可以檢測ROS1融合，但是基于DNA的NGS可能檢測不出ROS1融合。在某些情況下使用定向?qū)崟rPCR法，雖然不太可能發(fā)現(xiàn)與新的伴侶融合。
?BRAF（B-Raf原癌基因）點突變：BRAF基因是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是典型的MAP/ERK信號通路的一部分。BRAF激活突變導致通過MAP/ERK通路的信號失控。
?BRAF突變可見于非小細胞肺癌中。已發(fā)現(xiàn)一個導致p.v600e改變的特定突變的存在與聯(lián)合口服BRAF與MEK抑制劑治療起效相關(guān)。
?應注意BRAF的一些其它突變也可見于非小細胞肺癌中，這些突變對治療選擇的影響目前尚不太清楚。
?檢測方法：檢測BRAF突變狀態(tài)的方法有實時PCR、桑格測序（理想的是配以腫瘤富集）和最常用的NGS。盡管抗-BRAF p.V600E特異性單克隆抗體可在市場上買到，而且在一些研究中使用了這種方法進行檢查，但是，只能在經(jīng)過大規(guī)模的驗證之后才能使用。
?KRAS（KRAS原癌基因）點突變：KRAS是一個本身具有GTP酶活性的G-蛋白，活化突變將導致通過MAP/ERK通路的信號失控。
?在非小細胞肺癌中的KRAS突變最常見于12密碼子，雖然可以見到其它部位的突變。
?與腫瘤無KRAS突變的患者相比，存在一種KRAS突變預示生存期差。
?KRAS突變與對EGFR TKI治療的療效降低相關(guān)。
?由于出現(xiàn)可以靶向的重疊變異的可能性較低，因此，存在一種已知KRAS激活突變可以識別將不可能從進一步分子檢測中獲益的患者。
NSCL-H,4/5
MET、RET、NTRK、靶向治療中進展情況下的檢測
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?MET（間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化）外顯子14（METex14）跳躍變異：MET是一種受體酪氨酸激酶。在NSCLC中，可能發(fā)生導致外顯子14缺失的突變。METex14的缺失會導致調(diào)節(jié)失調(diào)和不適當?shù)男盘杺鲗А?/p>
?METex14跳躍突變的存在與對口服MET TKI的反應性相關(guān)。
?一系列的分子學變異導致METex14跳躍。
?檢測方法：基于NGS的檢測法是檢測METex14跳躍事件的主要方法，基于RNA的NGS顯示出檢測的改進。IHC不是檢測METex14跳躍的方法。
?RET（轉(zhuǎn)染過程中重排）基因重排：RET是一種受體酪氨酸激酶，可以在NSCLC中重排，通過RET激酶結(jié)構(gòu)域?qū)е率д{(diào)和不適當?shù)男盘杺鲗А?/p>
?常見的融合伴侶是KIF5B、NCOA4和CCDC6；但是，已經(jīng)確定了許多其它融合伴侶。
?RET重排的存在與對口服RET TKI的反應性相關(guān)，而與融合伴侶無關(guān)。
?檢測方法：可以使用FISH Break-Apart探針方法；但是，它可能檢測不到一些融合。靶向?qū)崟r逆轉(zhuǎn)錄酶PCR分析法用于某些情況，盡管它們不太可能檢測到與新型伴侶的融合?；贜GS的方法具有高特異性，并且基于RNA的NGS用于融合檢測優(yōu)于基于DNA的NGS。
?NTRK（神經(jīng)營養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶）基因融合
?NTRK1/2/3是酪氨酸受體激酶，在NSCLC和其它腫瘤類型中很少重新排列，發(fā)生重排將導致信號失調(diào)和失當。
?已經(jīng)確定了有許多融合伴侶。
?迄今為止，除了沒有其它驅(qū)動改變外，尚未發(fā)現(xiàn)與這些融合相關(guān)的任何特定的臨床病理特征。
?NTRK1/2/3中的點突變通常是非激活性的，尚沒有其與靶向治療相關(guān)性的研究。
?檢測方法：可以使用多種方法來檢測NTRK基因融合，包括：FISH、IHC、PCR和NGS；可能出現(xiàn)假陰性。IHC法由于在一些組織中存在基礎表達而變得復雜。FISH檢測法可能至少需要3組探針才能進行全面分析。NGS檢測法可以檢測到廣泛的變化。基于DNA的NGS可能檢測不到NTRK1和NTRK3融合。
●對于在治療開始之前無法合理完成對所有生物標志物全面評估的病例，如果病灶可以進行取樣和檢測，考慮在一線治療中出現(xiàn)疾病進展時復查基因組合測序或選定的生物標志物檢測。
●靶向治療中進展情況下的檢測：
?對于上述列出的許多分析物，人們對治療耐藥分子機制的認識逐漸增加。對靶向治療中活躍進展的標本進行重新檢測，可為制定下一步合理的治療方案提供線索：
?對于已經(jīng)接受過EGFR TKI治療、具有潛在EGFR敏感突變的患者，合理的檢測最起碼應包括高敏感性的p.t790M評估；當沒有p.T790M的證據(jù)時，檢測其它耐藥機制（MET擴增、ERBB2擴增）來指導患者接受其它治療。p.T790M是否存在，可指導患者接受第三代EGFR TKI治療。
—檢測EGFR p.T790M的分析法，分析靈敏度應該至少有5%的等位基因分數(shù)。如果p.T790M是在亞克隆事件中，初始敏感突變可用作許多分析的內(nèi)部對照，以確定p.T790M是否在檢測范圍內(nèi)。
?對于已接受過ALK TKI治療、具有潛在ALK重排的患者，尚不清楚識別特定酪氨酸激酶域突變是否可以確定下一步的合理治療方案，盡管一些初步數(shù)據(jù)表明一些特定激酶域突變可影響下一線治療。
NSCL-H,5/5
PD-L1、ctDNA檢測
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●PD-L1（程序性死亡配體1）：PD-L1是一個可以表達于腫瘤細胞的共調(diào)節(jié)分子，抑制T細胞介導的細胞死亡。T細胞表達PD-1，一個負調(diào)控因子，與配體（包括PD-L1[CD274]或PD-L2[CD273]）結(jié)合。存在PD-L1時，T細胞活性被抑制。
?檢查點抑制劑抗體阻斷PD-1和PD-L1的相互作用，從而提高內(nèi)源性T細胞的抗腫瘤作用。
?可以利用IHC檢測PD-L1以識別最可能對一線抗PD-1/PD-L1治療起效的腫瘤。
?已經(jīng)開發(fā)出用于IHC分析PD-L1表達的各種不同的抗體克隆，一些呈現(xiàn)相對等價，一些則不等價。
?PD-L1 IHC的判讀通常關(guān)注表達任何水平膜染色的腫瘤細胞的比例，因此是一種線性變量，在其它一些腫瘤類型中評分系統(tǒng)可能不同。
?FDA批準的PD-L1伴隨診斷方法可指導帕博麗珠單抗用于治療NSCLC患者，是基于腫瘤比例評分（TPS）。TPS是在任何強度下顯示部分或全部膜染色的活的腫瘤細胞的百分比。
?檢測結(jié)果陽性和陰性的界定取決于使用的特定抗體和平臺，其對每一種檢查點抑制劑治療可能是唯一的。有可能用于檢測PD-L1的多種不同方法已增加了病理科醫(yī)生和腫瘤科醫(yī)生的困擾。
?盡管在攜帶驅(qū)動突變的患者中，PD-L1表達可以升高，但針對致癌驅(qū)動突變的靶向治療應優(yōu)選于免疫檢查點抑制劑治療。
●血漿游離細胞/循環(huán)腫瘤DNA檢測
?不應使用游離細胞/循環(huán)腫瘤DNA檢測來代替組織學診斷。
?一些實驗室提供外周循環(huán)中核酸分子改變的檢測，最常見于經(jīng)處理的血漿中（有時稱為“液體活檢”）。
?一些研究表明：游離細胞腫瘤DNA檢測通常具有非常高的特異性，但靈敏度明顯折損，假陰性率高達30％。
?尚未確立游離細胞腫瘤DNA分析性能特征的標準，與基于組織的檢測相比，沒有關(guān)于此類檢測性能特征的指南。
?游離細胞腫瘤DNA檢測可發(fā)現(xiàn)與一些與所關(guān)注的病變無關(guān)的改變，如：不確定潛能的克隆性造血（CHIP）。
?在一些特定的臨床情況下，可以考慮使用游離細胞/循環(huán)腫瘤DNA檢測，尤其是：
?如果患者的全身狀況不適合行有創(chuàng)的組織取樣。
?初診時，如果在病理確診為非小細胞肺癌后沒有足夠的樣本行分子學分析，則只有在有計劃對所有游離細胞/循環(huán)腫瘤DNA檢測未發(fā)現(xiàn)致癌驅(qū)動突變（有關(guān)可用的靶向治療選項的致癌驅(qū)動因素，請參見NSCL-18）的患者接著行基于組織的分析時，才能行該項目（游離細胞/循環(huán)腫瘤DNA）檢測。
為轉(zhuǎn)移性NSCLC患者篩選新療法的新型生物標志物（NSCL-I）
英文版
中文版
參考文獻：
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END
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