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研究人員首先聚焦于細(xì)胞內(nèi)全局性蛋白節(jié)律性翻譯的分子調(diào)控機(jī)制。在細(xì)胞節(jié)律同步化后，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯存在節(jié)律性振蕩且翻譯高峰出現(xiàn)在節(jié)律時(shí)間CT(circadian time)12-16h。而小鼠在自然晝夜節(jié)律下，包括腦及肝在內(nèi)的組織層面的蛋白翻譯也存在節(jié)律性振蕩。為了進(jìn)一步研究調(diào)控此節(jié)律性翻譯的分子機(jī)制，研究人員分析了不同節(jié)律時(shí)間的全蛋白組，并初步找到了與蛋白翻譯節(jié)律振蕩模式類似的RNA結(jié)合蛋白ATXN2及其同源蛋白ATXN2L為潛在調(diào)控因子。有趣的是，ATXN2和ATXN2L單敲除的細(xì)胞節(jié)律相位向相反相反方向變化，顯示二者在不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)揮功能并協(xié)同調(diào)控蛋白翻譯（圖1）。為了進(jìn)一步探究ATXN2/2L在翻譯中的調(diào)控作用，研究人員使用了多核糖體圖譜分析技術(shù)(ribosome profiling)，結(jié)果顯示，翻譯高峰時(shí)間CT 12與翻譯低谷時(shí)間CT 4相比，野生型細(xì)胞中大量基因出現(xiàn)明顯的翻譯激活，而這群基因中一大部分的翻譯在ATXN2/2L雙敲除的細(xì)胞中無(wú)法被激活，表明ATXN2和ATXN2L為節(jié)律性翻譯的主調(diào)控分子。

圖1 野生型細(xì)胞、ATXN2/2L單敲除及雙敲除細(xì)胞的整體翻譯激活情況

那么下一個(gè)問(wèn)題是，ATXN2/2L如何共同起到調(diào)控節(jié)律性翻譯的作用。

通過(guò)對(duì)細(xì)胞和組織的染色觀察，研究人員發(fā)現(xiàn)ATXN2/2L在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)中樞生物鐘所在的視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）以及體外培養(yǎng)的細(xì)胞中都會(huì)形成蛋白凝聚體（圖2）。這些凝聚體位于核周且其大小及數(shù)量隨晝夜節(jié)律振蕩。研究人員通過(guò)Cryo-mill-IP的方法分離并分析了不同時(shí)間點(diǎn)ATXN2凝聚體中的蛋白組分，結(jié)果顯示，ATXN2凝聚體依時(shí)序招募并激活一系列的生化反應(yīng)，包括在CT 12 時(shí)招募RNA加工相關(guān)蛋白，在CT 16時(shí)大量募集翻譯起始因子和核糖體蛋白。

圖2 ATXN2/2L凝聚體大小及數(shù)量在U2OS細(xì)胞中隨晝夜節(jié)律振蕩

那么ATXN2/2L通過(guò)相分離調(diào)控生物鐘的具體分子機(jī)制是什么呢？

之前的研究表明，生物鐘調(diào)控由若干分子環(huán)路組成，其中包括一組時(shí)鐘基因（clock genes）構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋回路（Transcription-translation feedback loop, TTFLs）。哺乳動(dòng)物的TTFL中，轉(zhuǎn)錄激活因子CLOCK和BMAL1激活PER和CRY的轉(zhuǎn)錄，而Per 和Cry蛋白異二聚體轉(zhuǎn)移回細(xì)胞核，結(jié)合CLOCK-BMAL1 并停止轉(zhuǎn)錄激活。后續(xù)一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ATXN2/2L通過(guò)相分離參與到節(jié)律蛋白的翻譯調(diào)控中。ATXN2 作為RNA結(jié)合蛋白，其特異性地與RNA中的AUUUU/A motif結(jié)合，作者發(fā)現(xiàn)若干節(jié)律核心基因，例如PER2 RNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)富含該段序列。借助ATXN2體外液-液相分離(LLPS)的特性，研究人員證實(shí)ATXN2凝聚體能特異性招募富含該motif的節(jié)律分子RNA，而其他對(duì)照相分離液滴不具備該特性。在SCN中，同樣可以觀察到ATXN2凝聚體與PER2 RNA的共定位（圖3）。

圖3 ATXN2凝聚體在SCN中與PER2 mRNA共定位

為了建立相分離和翻譯調(diào)控的因果關(guān)系，研究人員利用體外翻譯系統(tǒng)證明ATXN2 相分離能促進(jìn)PER2 RNA的翻譯，并且在細(xì)胞內(nèi)可以直接觀察到PER2蛋白在ATXN2 凝聚體中合成的過(guò)程（圖4）。

圖4 利用SunTag技術(shù)觀察PER2蛋白在ATXN2凝聚體中合成

通過(guò)對(duì)ATXN2/2L雙敲除細(xì)胞進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，研究人員證實(shí)ATXN2野生型可以回補(bǔ)細(xì)胞全局翻譯以及節(jié)律基因的振蕩表型，而相分離突變體無(wú)法回補(bǔ)相關(guān)節(jié)律表型。

最后，研究人員將所發(fā)現(xiàn)機(jī)制在動(dòng)物層面進(jìn)行了驗(yàn)證。他們對(duì)野生型和ATXN2/2L基因敲除小鼠進(jìn)行了運(yùn)動(dòng)節(jié)律行為檢測(cè)，并比較了節(jié)律參數(shù)的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在SCN中條件性敲除ATXN2或2L后，小鼠晝夜節(jié)律的周期長(zhǎng)度發(fā)生相反方向的變化，而當(dāng)兩個(gè)基因同時(shí)敲除后，小鼠節(jié)律的穩(wěn)定性顯著下降。

綜上，此項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ATXN2和ATXN2L在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相分離，且其相分離隨晝夜節(jié)律振蕩，闡釋了其相分離形成的液滴隨節(jié)律振蕩并依序招募和富集一系列RNA相關(guān)的生物過(guò)程，并在振蕩高峰期募集核糖體和特異RNA，促進(jìn)關(guān)鍵節(jié)律蛋白的翻譯。這個(gè)在翻譯上的加速環(huán)節(jié)在整個(gè)TTFL中起到了穩(wěn)定和精確調(diào)控節(jié)律周期的作用（圖5）。

圖5 ATXN2/2L相分離調(diào)控節(jié)律性蛋白翻譯的分子機(jī)制模型圖

相分離作為一種重要的物理化學(xué)機(jī)制，參與調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)的眾多生理過(guò)程。生物大分子發(fā)生相分離并形成無(wú)膜細(xì)胞器（membrane-less organelles, MLOs），使細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)區(qū)室化，從而對(duì)各種生理活動(dòng)實(shí)現(xiàn)精細(xì)的時(shí)空調(diào)控。本文揭示了相分離調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律中翻譯的功能。之前關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究表明，不同蛋白凝聚體在轉(zhuǎn)錄過(guò)程的不同階段，包括起始、延伸和終止發(fā)揮功能。本研究中揭示的相分離對(duì)于翻譯起始階段的促進(jìn)進(jìn)一步支持了細(xì)胞內(nèi)信息液相流動(dòng)(liquid information flow)的模型。

此外，之前大多數(shù)相分離的研究系統(tǒng)是在生理穩(wěn)態(tài)或單向轉(zhuǎn)變（例如，壓力以及細(xì)胞分化條件）的細(xì)胞環(huán)境下進(jìn)行的。本文中隨晝夜節(jié)律振蕩的相分離系統(tǒng)為未來(lái)研究相分離對(duì)各種細(xì)胞活動(dòng)的時(shí)空調(diào)節(jié)提供全新的視角。此外，ATXN2是一個(gè)與多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)的蛋白，因此本研究也對(duì)未來(lái)的疾病研究具有指導(dǎo)意義，未來(lái)相關(guān)疾病的治療應(yīng)根據(jù)文中揭示的ATXN2凝聚體的節(jié)律振蕩特性仔細(xì)考慮診斷和治療干預(yù)的時(shí)機(jī)。

吝易實(shí)驗(yàn)室博士研究生莊妍榕為本文第一作者，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生李志原、熊詩(shī)玥與孫楚杰為本文的共同第一作者。吝易研究員與楊雪瑞研究員為共同通訊作者。

本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科技部、膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生物信息學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的大力支持。非常感謝各位熱心同事的寶貴建議和鼓勵(lì)。

相關(guān)論文信息：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.05.045

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、清華-IDG/麥戈文腦科學(xué)研究院吝易課題組長(zhǎng)期致力于解析生物大分子相分離的性質(zhì)及分子機(jī)理 ，并建立異常相分離與細(xì)胞死亡，尤其是與神經(jīng)退行性疾病之間的關(guān)系。本課題組希望利用生化、細(xì)胞及神經(jīng)生物學(xué)手段，建立體內(nèi)外研究模型，系統(tǒng)性地研究幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：

1. 解析細(xì)胞內(nèi)無(wú)膜細(xì)胞器形成的特異性以及分子機(jī)制；

2. 探索生物大分子相分離對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的生理意義；

3. 通過(guò)人工干預(yù)的手段調(diào)控病理狀態(tài)下的異常相變，最終達(dá)到治療神經(jīng)退行性疾病的目的。

歡迎分子及細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生物物理學(xué)或生物信息學(xué)等相關(guān)專業(yè)背景的有志科研之士申請(qǐng)博士后及科研助理職位。本招聘長(zhǎng)期有效。

導(dǎo)師信息及相關(guān)個(gè)人頁(yè)面：

http://www.life.tsinghua.edu.cn/info/1035/2498.htm。

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