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“朝搴阰之木蘭兮，夕攬洲之宿莽。”

“晨興理荒穢，帶月荷鋤歸?！?/p>

地球自轉造就日月流轉，晝夜更替。正如屈原和陶淵明分別在詩句中描繪的那樣，為適應這種規(guī)律，在宏觀層面上的人類活動在時間和空間上隨晝夜變化。而在微觀層面上，細胞中的眾多生物過程也隨著晝夜節(jié)律在時間和空間上受到嚴格調(diào)控，精妙地協(xié)調(diào)多種生物過程的振蕩，形成無形的生物鐘。

之前的研究表明，生物鐘調(diào)控由若干分子環(huán)路組成，其中包括一組時鐘基因（clock genes）構成的轉錄翻譯負反饋回路（Transcription-Translation Feedback Loop, TTFL）。在這個回路中，轉錄、mRNA加工、蛋白質(zhì)翻譯過程以晝夜節(jié)律模式進行，從而精準調(diào)控眾多基因的節(jié)律周期。但這些過程在時間和空間上的節(jié)律性是如何實現(xiàn)的，仍有大量謎題有待破解。

清華大學生命科學學院、清華-IDG/麥戈文腦科學研究院、清華-北大生命科學聯(lián)合中心吝易課題組與清華大學生命科學學院楊雪瑞課題組合作在Cell 發(fā)表研究論文，該研究揭示了細胞中利用相分離協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)翻譯的精細時空調(diào)控，從而維持晝夜節(jié)律周期的分子機制。

 

研究人員首先聚焦于細胞內(nèi)全局性蛋白節(jié)律性翻譯的分子調(diào)控機制。在細胞節(jié)律同步化后，研究人員發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)蛋白翻譯存在節(jié)律性振蕩，且翻譯高峰出現(xiàn)在一個晝夜節(jié)律周期開始后的12-16小時，即節(jié)律時間（circadian time, CT）12-16。

為了進一步研究調(diào)控此節(jié)律性翻譯的分子機制，研究人員分析了不同節(jié)律時間的全蛋白組，并找到了與蛋白翻譯節(jié)律振蕩模式類似的RNA結合蛋白ATXN2及其同源蛋白ATXN2L為潛在調(diào)控因子。隨后的分析進一步驗證了ATXN2和ATXN2L為節(jié)律性翻譯的主調(diào)控分子。有趣的是，ATXN2和ATXN2L單敲除的細胞節(jié)律相位向相反方向變化，顯示二者在不同時間點發(fā)揮功能并協(xié)同調(diào)控蛋白翻譯。

 

圖1 野生型細胞、ATXN2/2L單敲除及雙敲除細胞的整體翻譯激活情況

下一個問題是，ATXN2/2L如何共同起到調(diào)控節(jié)律性翻譯的作用？

 

通過對細胞和組織的染色觀察，研究人員發(fā)現(xiàn)ATXN2/2L在哺乳動物腦內(nèi)中樞生物鐘所在的視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）以及體外培養(yǎng)的細胞中都會形成蛋白凝聚體。這些凝聚體位于核周且大小及數(shù)量隨晝夜節(jié)律振蕩。對不同時間點中ATXN2凝聚體中的蛋白組分顯示，ATXN2凝聚體依時序招募并激活一系列生化反應，包括在CT 12時招募RNA加工相關蛋白，在CT 16時大量募集翻譯起始因子和核糖體蛋白。

 

圖2 ATXN2/2L凝聚體大小及數(shù)量在U2OS細胞中隨晝夜節(jié)律振蕩

 

后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，ATXN2/2L通過相分離參與到節(jié)律蛋白的翻譯調(diào)控中。生物大分子發(fā)生相分離并形成無膜細胞器，使細胞內(nèi)生化反應區(qū)室化，從而對各種生理活動實現(xiàn)精細的時空調(diào)控。隨后的研究探索了ATXN2/2L通過相分離調(diào)控生物鐘的具體分子機制。

 

ATXN2 作為RNA結合蛋白，傾向于結合mRNA中尿苷豐富的區(qū)域，尤其是特異性地與AUUUU/A motif結合。作者發(fā)現(xiàn)，PER2（Period基因家族成員，是調(diào)控晝夜節(jié)律的核心基因之一） mRNA的3'非翻譯區(qū)富含該段序列。借助ATXN2體外液-液相分離（LLPS）的特性，研究人員證實ATXN2凝聚體能特異性招募富含該motif的節(jié)律分子RNA，而其他對照相分離液滴不具備該特性。在SCN中，同樣可以觀察到ATXN2凝聚體與PER2 mRNA的共定位。

圖3 ATXN2凝聚體在SCN中與PER2 mRNA共定位

研究人員利用體外翻譯系統(tǒng)證明ATXN2相分離能促進PER2 mRNA的翻譯，并且在細胞內(nèi)可以直接觀察到PER2蛋白在ATXN2 凝聚體中合成的過程，這些結果建立起相分離和翻譯調(diào)控的因果關系。

圖4 利用SunTag技術觀察PER2蛋白在ATXN2凝聚體中合成

 

最后，研究人員將所發(fā)現(xiàn)的機制在動物層面進行了驗證。他們對野生型和ATXN2/2L基因敲除小鼠進行了運動節(jié)律行為檢測，并比較了節(jié)律參數(shù)的變化。實驗發(fā)現(xiàn)，在SCN中條件性敲除ATXN2或ATXN2L后，小鼠晝夜節(jié)律的周期長度發(fā)生相反方向的變化，而當兩個基因同時敲除后，小鼠節(jié)律的穩(wěn)定性顯著下降。

綜上，此項研究發(fā)現(xiàn)ATXN2和ATXN2L在細胞內(nèi)發(fā)生相分離，且其相分離隨晝夜節(jié)律振蕩，闡釋了其相分離形成的液滴隨節(jié)律振蕩并依序招募、富集一系列RNA相關的生物過程，并在振蕩高峰期募集核糖體和特異RNA，促進關鍵節(jié)律蛋白的翻譯。這個在翻譯上的加速環(huán)節(jié)，在整個TTFL中起到了穩(wěn)定和精確調(diào)控節(jié)律周期的作用。

圖5 ATXN2/2L相分離調(diào)控節(jié)律性蛋白翻譯的分子機制模型圖

之前關于轉錄調(diào)控的研究表明，不同蛋白凝聚體在轉錄過程的不同階段，包括起始、延伸和終止階段發(fā)揮功能。本研究中揭示的相分離對于翻譯起始階段的促進，進一步支持了細胞內(nèi)信息液相流動(liquid information flow)的模型。本文中隨晝夜節(jié)律振蕩的相分離系統(tǒng)，也為未來研究相分離對各種細胞活動的時空調(diào)節(jié)提供全新的視角。此外，ATXN2是一個與多種神經(jīng)退行性疾病密切相關的蛋白，因此本研究也對未來的疾病研究具有指導意義。

清華大學生命科學學院吝易實驗室2019級博士研究生莊妍榕為第一作者，清華大學生命科學學院2018級博士研究生李志原、2021級熊詩玥、與2018級孫楚杰為本文的共同第一作者。本研究得到了國家自然科學基金委員會、科技部、膜生物學國家重點實驗室、生物信息學教育部重點實驗室的大力支持。

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