今天給大家介紹一款好玩的技術(shù)應(yīng)用。雖然技術(shù)不是特別新鮮，但是應(yīng)用到生物鐘網(wǎng)絡(luò)中，仍然讓在下驚嘆甚為巧妙！這篇文章是英國(guó)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)的Michael Hasting教授課題組于2018年11月新發(fā)表在PNAS上。
——生物鐘網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)介——
先簡(jiǎn)單介紹下生物鐘的背景知識(shí)。我們知道很多行為表型的產(chǎn)生都是受內(nèi)在的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的，對(duì)于我們?nèi)梭w的生物鐘節(jié)律來(lái)講，亦是如此。我們之所以會(huì)有較為正常的睡眠清醒周期循環(huán)，都是受生物鐘這個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控。生物鐘的核心分子網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)由四個(gè)元件構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋循環(huán)。轉(zhuǎn)錄因子CLOCK和BMAL激活下游負(fù)調(diào)控元件Cry和Per基因的轉(zhuǎn)錄，二者在細(xì)胞質(zhì)中翻譯完成后入核抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而抑制自身基因的轉(zhuǎn)錄，形成負(fù)反饋，如圖1。隨著CRY和PER蛋白的降解，二者對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用被解除，則開(kāi)啟下一個(gè)循環(huán)。從而形成了這樣一個(gè)循環(huán)往復(fù)的振蕩過(guò)程。宏觀上的表現(xiàn)為，在此振蕩行為調(diào)控下，我們很多體征也表現(xiàn)為振蕩現(xiàn)象，比如前文提到的睡眠清醒周期循環(huán)過(guò)程中涉及到的褪黑素水平的振蕩現(xiàn)象。夜晚褪黑素水平升高，告訴我們，我們累了需要休息了，白天褪黑素水平降低，告訴我們?cè)搹乃瘔?mèng)中清醒開(kāi)始工作了。再比如我們的代謝過(guò)程、免疫能力等等都會(huì)有這樣一個(gè)24h的振蕩變化。
圖1 生物鐘核心分子網(wǎng)絡(luò) [2]
上述的整個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)存在于幾乎所有類型的細(xì)胞中，而生物鐘網(wǎng)絡(luò)和古代的帝王制度一樣，等級(jí)極為分明。所有的外周組織的生物鐘節(jié)律都受到大腦一個(gè)叫做SCN區(qū)域的調(diào)控。今天介紹的這篇文章主要著眼于核心調(diào)控者SCN組織的節(jié)律調(diào)控，通過(guò)可逆性地編輯小鼠SCN區(qū)域的節(jié)律元件，實(shí)現(xiàn)小鼠全身的節(jié)律行為的可逆性調(diào)節(jié)。
——CRY蛋白的翻譯開(kāi)關(guān)設(shè)計(jì)——
前文介紹的生物鐘網(wǎng)絡(luò)中的核心元件CRY的雙敲會(huì)導(dǎo)致小鼠全身性的節(jié)律紊亂。本文便選取這樣的模式小鼠，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一個(gè)翻譯開(kāi)關(guān)，進(jìn)行CRY蛋白翻譯的可逆性調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)小鼠生物鐘節(jié)律有無(wú)的可逆性調(diào)節(jié)。核心設(shè)計(jì)原理是利用正交的aminoacyl-tRNA synthetase/tRNACUA對(duì)，通過(guò)腺病毒感染的方式引入SCN組織中。腺病毒感染的載體在表達(dá)CRY1蛋白時(shí)，在異位終止密碼子處引入非天然的氨基酸，使得只有提供此非天然氨基酸的情況下，此閱讀框才能完整轉(zhuǎn)錄，當(dāng)此非天然氨基酸缺失時(shí)，則轉(zhuǎn)錄過(guò)程會(huì)在此異位終止密碼子處停止，CRY1蛋白則不能夠完成表達(dá)過(guò)程。
圖2 腺病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒結(jié)構(gòu)
作者主要構(gòu)建了兩個(gè)載體，一個(gè)是在hU6啟動(dòng)子后面插入了正交的pyrrolysyl-tRNAcua（PylT）和pyrrolysyl-tRNA合成酶PylRS（PylS）基因，后面帶了一個(gè)mCherry報(bào)告基因（見(jiàn)圖2上），通過(guò)mCherry的信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)表征腺病毒載體編碼合成酶/tRNA對(duì)的活性強(qiáng)弱。另外一個(gè)載體，腺病毒Cry1-Cry1（177TAG）::EGFP，編碼感興趣的CRY1蛋白，C端帶了一個(gè)EGFP的標(biāo)簽蛋白來(lái)使蛋白表達(dá)過(guò)程可視化。Cry1可以通過(guò)Cry1啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但在異位終止密碼子TAG處有特定氨基酸依賴性。腺病毒載體將pyrrolysyl-tRNA合成酶（PylRS）的底物--非天然氨基酸炔賴氨酸（ncAA alkyne lysine,簡(jiǎn)稱AlkK）引入Cry1表達(dá)過(guò)程中，使得Cry1翻譯過(guò)程呈現(xiàn)AlkK依賴性，只有AlkK存在時(shí)，Cry1才能完成翻譯，否在在異位終止密碼子處則會(huì)終止表達(dá)。這也就對(duì)生物鐘網(wǎng)絡(luò)中CRY1蛋白的表達(dá)與否實(shí)現(xiàn)了可逆性調(diào)節(jié)，從而使細(xì)胞或者小鼠生物鐘節(jié)律的有無(wú)也實(shí)現(xiàn)了可逆性調(diào)節(jié)（見(jiàn)圖3），為研究生物鐘網(wǎng)絡(luò)提供了一個(gè)非常方便快捷的方法，同時(shí)這個(gè)方法也可以廣泛應(yīng)用到其他神經(jīng)生物學(xué)或者細(xì)胞生物學(xué)的領(lǐng)域中。
圖3 Cry1表達(dá)開(kāi)關(guān)控制生物鐘節(jié)律
可以明顯的看到在沒(méi)有非天然氨基酸AlkK時(shí)，細(xì)胞看不到振蕩現(xiàn)場(chǎng)，加1mM AlkK后，振蕩現(xiàn)象極為明顯，將AlkK洗掉后，則振蕩現(xiàn)象又消失不見(jiàn)。
總之，Hasting教授的此工作為研究生物鐘網(wǎng)絡(luò)提供了一個(gè)非常方便快捷的方法，同時(shí)這個(gè)方法也可以廣泛應(yīng)用到其他神經(jīng)生物學(xué)或者細(xì)胞生物學(xué)的領(lǐng)域中。
參考文獻(xiàn)：
[1] Maywood, Elizabeth S., et al."Translational switching of Cry1 protein expression confers reversiblecontrol of circadian behavior in arrhythmic Cry-deficient mice."Proceedings of the National Academy of Sciences (2018): 201811438. https://doi.org/10.1073/pnas.1811438115
[2] https://events.umich.edu/event/33581
作者：小魚(yú)兒
編輯：蔡臣靜
GoDesign
ID：Molecular_Design_Lab
聯(lián)系客服
