一．FISH主要受哪些因素的影響？
FISH受光照、溫度、濕度和各種試劑的pH影響。溫度和濕度直接影響探針與目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強(qiáng)度，所以探針要避光保存，已經(jīng)雜交的片子可用熒光淬滅劑封片且避光保存；各種試劑pH也要精確達(dá)到要求，這會(huì)直接影響FISH的穩(wěn)定性。
二．熒光原位雜交的基本原理是什么[1]？
FISH是一種利用熒光標(biāo)記DNA探針來(lái)檢測(cè)一般在常規(guī)染色體顯帶檢查的分辨率之外的基因變異的常用技術(shù)；其原理是基于單鏈DNA分子的識(shí)別并結(jié)合至中期染色體或間期核中的互補(bǔ)序列。
探針和靶DNA用熱甲酰胺溶液處理，使雙鏈DNA變性。然后，探針與靶DNA在37℃下孵育，以通過(guò)探針與靶序列互補(bǔ)堿基配對(duì)來(lái)退火。配備適當(dāng)濾鏡的熒光顯微鏡被用于檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)上有無(wú)明顯信號(hào)的雜交探針。同一目標(biāo)可同時(shí)用不同顏色熒光標(biāo)記的多個(gè)探針，以檢測(cè)基因組的一個(gè)或多個(gè)特定區(qū)域。
FISH經(jīng)常在培養(yǎng)細(xì)胞的分裂中期染色體上進(jìn)行，使探針信號(hào)直接定位到染色體上，以檢測(cè)染色體的先天或獲得性改變。FISH也可用于不分裂細(xì)胞的靶基因組序列，以識(shí)別細(xì)胞周期階段無(wú)關(guān)的染色體畸變。這種技術(shù)稱(chēng)為間期FISH（interphase FISH，iFISH），用于多種臨床標(biāo)本的染色體計(jì)數(shù)和染色體重排的鑒定。
三．DNA-FISH與RNA-FISH的區(qū)別？
DNA-FISH和RNA-FISH都可以在同一個(gè)樣本中直觀顯示多個(gè)標(biāo)靶，并且能夠重復(fù)用，前者能用熒光顯微法觀察，后者既能用熒光顯微法觀察，還能進(jìn)行HCS和流式細(xì)胞分析。DNA-FISH主要應(yīng)用于基因存在、拷貝數(shù)和位置識(shí)別以及突變分析；RNA-FISH主要應(yīng)用于識(shí)別基因表達(dá)、RNA的時(shí)間和空間定位。
四．DNA-FISh探針的主要分類(lèi)和用途[2]？
著絲粒探針（CSP探針）：用于檢測(cè)染色體數(shù)目異常如三體、單體等；染色體臂或整條染色體涂染探針（WPP探針）：用于檢測(cè)染色體易位和標(biāo)記染色體；序列特異性探針（GLP探針）：包括臂、帶和基因探針等多種；除此之外，還有亞端粒探針，靠近端粒的200-300Kb為染色體特異性DNA，用于檢測(cè)涉及端粒的隱匿性易位。
五．直標(biāo)型探針和間標(biāo)型探針的區(qū)別？
直標(biāo)探針是指DNA探針共價(jià)連接熒光素基團(tuán)；間標(biāo)型探針是指DNA探針先于某個(gè)半抗原連接，諸如地高辛或生物素，然后半抗原與熒光素基團(tuán)連接從而形成探針-半抗原-熒光素基團(tuán)，類(lèi)似“三明治”的復(fù)合物。
與間標(biāo)探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性的特點(diǎn)。隨著熒光染料和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，靈敏度不斷提高。因而在FISH檢測(cè)領(lǐng)域，尤其在疾病分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計(jì)。
六．外周血樣本做FISH的處理過(guò)程是什么[3]？
1、使用鑷子小心地揭去雜交區(qū)的蓋玻片；
2、將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。對(duì)于多次雜交，復(fù)染液濃度的降低有利于保持探針的亮度。也可對(duì)已經(jīng)進(jìn)行G帶顯色的樣本片進(jìn)行FISH操作：將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。
七．熒光信號(hào)在短時(shí)間急劇衰退的原因可能是？
正常情況下，雜交后的探針如果能保存適當(dāng)，熒光信號(hào)能保持半年以上。出現(xiàn)短時(shí)間衰減的情況主要是因?yàn)椴僮饔^察過(guò)程中或是探針的保存過(guò)程中沒(méi)有采取嚴(yán)格的避光措施。
陽(yáng)光或是強(qiáng)的燈光都會(huì)時(shí)都會(huì)使熒光染料發(fā)生急劇的淬滅，從而造成了觀察結(jié)果的不確定。因此在操作和觀察時(shí)，盡可能在暗室中操作，也可在封片觀察時(shí)加入一定的抗淬滅劑以延緩熒光素的淬滅。
八．FISH技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有哪些？
（1）安全、快速、靈敏度高；
（2）探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；
（3）多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；
（4）可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；
（5）可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。
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[1] Pang M G , Hoegerman S F , Cuticchia A J ,et al.Detection of aneuploidy for chromosomes 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 17, 18, 21, X and Y by fluorescence in-situ hybridization in spermatozoa from nine patients with oligoasthenoteratozoospermia undergoing intracytoplasmic sperm injection[J].Human Reproduction, 1999(5):1266-73.
[2] Eugenia,Bezirtzoglou,and,et al.Microbiota profile in feces of breast- and formula-fed newborns by using fluorescence in situ hybridization (FISH)[J].Anaerobe, 2011.
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