前 言
基因的變異類型有多種（點(diǎn)擊查看），對(duì)應(yīng)的分子檢測(cè)方法亦有多種，當(dāng)前資本市場(chǎng)驅(qū)動(dòng)著分子檢測(cè)市場(chǎng)，并極力追捧NGS技術(shù)，因?yàn)槠渫扛?，靈敏度高且性價(jià)比高。小編承認(rèn)NGS是分子檢測(cè)的必然發(fā)展趨勢(shì)，但是短時(shí)間內(nèi)，NGS并不會(huì)取代其他分子檢測(cè)方法，因?yàn)獒槍?duì)不同的需求，都有對(duì)應(yīng)的理想檢測(cè)方法，每個(gè)檢測(cè)平臺(tái)都有著自己的優(yōu)勢(shì)，比如：
操作簡(jiǎn)單：PCR，ARMS-PCR，HRM等
時(shí)間快速：ARMS-PCR，HRM等
成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等
準(zhǔn)確：Sanger等
通量高：NGS等
靈活性：Pyrosequencing等
結(jié)果分析簡(jiǎn)單：ARMS-PCR等
自動(dòng)化：核酸提取等
......
小編一直認(rèn)為：沒(méi)有最好的技術(shù)，只有最合適的技術(shù)！最好的，不一定是最合適的；最合適的，才是真正最好的。
今天，我們聊一聊FISH檢測(cè)技術(shù)，F(xiàn)ISH是魚(yú)嘛？FISH會(huì)發(fā)光？FISH的紅綠黃點(diǎn)是啥？是色彩斑斕的魚(yú)？
This FISH？（貓表示一臉懵逼）
首先，我們先了解下什么是FISH？
FISH：熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization， FISH），利用雜交的原理，用熒光染料標(biāo)記探針DNA，變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核特定靶DNA序列雜交，然后通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)熒光信號(hào)位置、大小及數(shù)量來(lái)判斷待測(cè)序列的缺失、擴(kuò)增及易位等情況。
熒光原位雜交（FISH）
熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)（放射性標(biāo)記探針靈敏度很高，能夠檢測(cè)小至幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA序列，但是由于同位素的安全問(wèn)題、半衰期、信號(hào)統(tǒng)計(jì)等限制了此項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，后來(lái)逐漸發(fā)展出了非放射性標(biāo)記探針原位雜交技術(shù)：直接法（熒光素/其他染料）；間接法（地高辛/生物素））。它的基本原理是：如果被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。
FISH檢測(cè)的基本原理
常見(jiàn)五種FISH探針
關(guān)于FISH檢測(cè)的探針，一般分為間標(biāo)型探針和直標(biāo)型探針：
1，間標(biāo)型探針是指DNA探針先與某個(gè)半抗原連接，諸如生物素或地高辛，然后半抗原與熒光素基團(tuán)連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團(tuán)，類似“三明治”的復(fù)合物。
【生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），二硝基苯基（DNP），aminoacetyl fluorine（AAF）等均可用于探針標(biāo)記。前兩者較為常用，通常采用切口平移法或隨機(jī)引物法對(duì)探針標(biāo)記。如兩個(gè)不同的探針?lè)謩e用Biotin和Digoxigenin標(biāo)記，雜交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分別與探針上的Biotin 和Digoxigenin結(jié)合，應(yīng)用雙色濾光片，在顯微鏡下就可以同時(shí)看見(jiàn)帶有綠色熒光的FITC和紅色熒光的Texas-Red信號(hào)。同理，采用三種或三種以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等標(biāo)記探針，然后用多種不同顏色的熒光素，如FITC（綠色），Rhodamine（紅色），AMA或Cascade Blue（藍(lán)色）等結(jié)合抗體進(jìn)行檢測(cè)，可同時(shí)得到多種不同顏色的熒光信號(hào)，如采用不同的排列組合，最多可同時(shí)檢測(cè)7種不同的探針。】
2，直標(biāo)型探針是指DNA探針共價(jià)連接熒光素基團(tuán)：近年來(lái)，Vysis 公司成功的生產(chǎn)些大片段的DNA探針（100-400kb）。由于探針較長(zhǎng)故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過(guò)程進(jìn)一步簡(jiǎn)化，而且雜交信號(hào)更強(qiáng)。與間標(biāo)型探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性的特點(diǎn)。隨著熒光染料和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，直標(biāo)型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是在疾病分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計(jì)。
FISH選用的標(biāo)本可以是分裂期細(xì)胞染色體也可以是間期細(xì)胞，間期細(xì)胞可以是冰凍切片，也可以是細(xì)胞滴片或印片。任何熒光顯微鏡均可用于觀察FISH信號(hào)，但對(duì)單拷貝探針的信號(hào)需要質(zhì)量較好的熒光顯微鏡。
FISH技術(shù)一般用于了解基因或染色體發(fā)生擴(kuò)增、缺失、融合或斷裂；樣本來(lái)源廣泛：組織、脫落細(xì)胞、羊水、血液、骨髓都可以檢測(cè)，且不僅限于新鮮樣本，2-3年的石蠟樣本都可以檢測(cè)；FISH檢測(cè)在分子檢測(cè)里是收費(fèi)最低的而且很多地方FISH檢測(cè)都進(jìn)入醫(yī)保可報(bào)銷范疇。
在FISH中最重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強(qiáng)度，因此探針要避光保存，其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬滅劑封片且避光保存；各種試劑pH也要精確達(dá)到要求，這也直接關(guān)系到FISH的穩(wěn)定性。
目前FISH主要集中在DNA水平方面檢測(cè)，而針對(duì)RNA這塊比較困難，F(xiàn)ISH 技術(shù)作為連接分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)的橋梁地位已為世人所公認(rèn)。盡管目前FISH技術(shù)無(wú)法達(dá)到百分百完全雜交，特別是在應(yīng)用較短cDNA探針時(shí)存在雜交效率明顯下降的問(wèn)題，但隨著各種新型分子探針以及更為精密高端的光學(xué)顯微鏡和功能強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)的不斷問(wèn)世，上述問(wèn)題將會(huì)逐步得到解決。
目前通過(guò)FISH方法可以檢測(cè)各條染色體的靶標(biāo)接近300余種，能夠滿足臨床上大部分腫瘤及遺傳疾病的檢測(cè)需求，這還不包括一些用于科研的罕見(jiàn)基因靶標(biāo)。
目前主要用于指導(dǎo)靶向藥物的使用如赫賽?。℉ER2）、克唑替尼（ALK/ROS1/CMET），腦膠質(zhì)瘤獨(dú)特類型（1p19q）等。
一般做FISH需要CEP探針，CEP檢測(cè)著絲粒，CEP探針作為基因特異探針的實(shí)驗(yàn)對(duì)照，有其重要的意義。CEP探針也可獨(dú)立用于染色體檢測(cè)，可從總體上檢測(cè)染色體異常情況。
比如ALK-EML4基因FISH檢測(cè)：可設(shè)計(jì)兩個(gè)探針?lè)謩e針對(duì)ALK和EML4，可檢測(cè)染色體2p23位點(diǎn)的ALK基因（NCBI GeneID:238）與染色體2p21位點(diǎn)的EML4基因（NCBI GeneID: 27436）間發(fā)生的染色體異常易位。也可以針對(duì)ALK設(shè)計(jì)一個(gè)探針，但是如果發(fā)生了融合，也不能確定是何種融合類型。（見(jiàn)下圖）
可以設(shè)計(jì)已知融合基因的探針，比如針對(duì)ALK和EML4的，ALK全部用紅色探針覆蓋，EML4用黃色探針覆蓋，正常就是紅黃分開(kāi)，融合就是紅黃在一起。
可以設(shè)計(jì)已知融合基因的探針，比如針對(duì)ALK的，用紅色和黃色覆蓋ALK基因的上下游區(qū)域，正常就是紅黃在一起，融合就是ALK發(fā)生了斷裂就是紅黃分開(kāi)了。
比如EGFR基因FISH檢測(cè)：可用一個(gè)CEP07探針加一個(gè)EGFR基因探針，兩種探針的混合物，一種探針檢測(cè)EGFR基因，另一種檢測(cè)7號(hào)染色體的著絲點(diǎn)，可特異檢測(cè)位于7號(hào)染色體的EGFR基因（NCBI GeneID:1956）的異常擴(kuò)增。
實(shí)例1：兩名乳腺癌患者，考慮是否使用曲妥珠單抗，對(duì)HER2基因擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。（FISH為HER2檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)）
HER2的FISH檢測(cè)
實(shí)例2：兩名非小細(xì)胞肺癌患者，考慮是否使用克唑替尼，對(duì)ALK融合基因進(jìn)行檢測(cè)。
ALK的FISH檢測(cè)
對(duì)于FISH檢測(cè)結(jié)果的解讀，一般根據(jù)探針的要求，分為以下兩種：
1，數(shù)目探針：直接觀察基因標(biāo)記顏色進(jìn)行計(jì)數(shù)確定數(shù)值或者平均拷貝數(shù)，根據(jù)不同探針說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行判斷，比如乳腺癌HER2基因有明確的指南，先看比值，再看拷貝數(shù)，有一些則是直接看比值。（比如HER2：計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞，HER2紅綠比值大于2，且 HER2拷貝數(shù)大于6，點(diǎn)狀擴(kuò)增陽(yáng)性；HER2信號(hào)成簇，綠色CSP17信號(hào)正常，直接判讀簇狀擴(kuò)增）
2，結(jié)構(gòu)探針：先要明確異常信號(hào)模式，然后再計(jì)數(shù)各種異常信號(hào)的細(xì)胞個(gè)數(shù)占觀察區(qū)域總體細(xì)胞比例，再比對(duì)判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。（比如ALK：計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)1紅1綠1融合細(xì)胞比例>15%，判讀為陽(yáng)性，如果比值接近15%，需要擴(kuò)大計(jì)數(shù)范圍；未發(fā)生紅綠分離，但是出現(xiàn)了染色體多倍體，判讀為陰性）
優(yōu)點(diǎn)：
1，安全、快速、靈敏度高；
2，探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；
3，多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；
4，可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；
5，可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。
缺點(diǎn)：
1，不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降；
2，沒(méi)辦法準(zhǔn)確判斷斷裂基因的具體坐標(biāo)位置，進(jìn)一步判斷需要RNA seq來(lái)檢測(cè)。
此方法適宜于實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)單快速的進(jìn)行基因擴(kuò)增、融合及拷貝數(shù)變異的檢測(cè)和評(píng)估。
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