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熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization）簡(jiǎn)稱FISH。這是一個(gè)形態(tài)與分子相結(jié)合的檢測(cè)平臺(tái)，在基礎(chǔ)病理與分子病理檢測(cè)中都是能手。話不多說，先上張好看的圖！

*miR-133(green) and myogenin mRNA (red) in C2C12differentiating cells

原理：原位雜交是在組織、細(xì)胞或染色體等水平對(duì)DNA或RNA進(jìn)行定性、定位或定量分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，熒光原位雜交則是使用了熒光標(biāo)記的探針特異性地與目標(biāo)序列雜交，分為DNA-FISH和RNA-FISH，以DNA-FISH為例，下圖顯示了關(guān)鍵的雜交變性過程。

*DNA-FISH與RNA-FISH的特點(diǎn)比較

以臨床常用的DNA-FISH為例，咱們記幾句入門口訣：

?  FISH檢測(cè)的是DNA，不是蛋白質(zhì)，所以它和免疫組化是不一樣的；

?  FISH是在標(biāo)本原位上直接檢測(cè)DNA，這些DNA不用提純，所以他和PCR是不一樣的；

?  FISH檢測(cè)可在間期細(xì)胞上進(jìn)行，有別于核型分析；

?  FISH探針種類很多，不是說一種探針可以檢測(cè)所有的腫瘤基因檢測(cè)項(xiàng)目；

?  FISH需要檢測(cè)的是一段相對(duì)較長(zhǎng)的DNA片段（至少100kb），所以簡(jiǎn)單的突變（只有1個(gè)或者幾個(gè)堿基改變或者缺失）不能用FISH檢測(cè)；

FISH儀器中最主要（最昂貴的）的是分析工作站（熒光顯微鏡、分析照相軟件）和熒光原位雜交儀。

從FISH的原理就可以看出，它所采用的熒光標(biāo)記的探針，是其技術(shù)的核心，這次我們主要講一下熒光標(biāo)記的DNA探針，也是目前醫(yī)學(xué)上最廣泛使用的。

FISH探針的主要分類和用途：

著絲粒探針（CSP探針）：用于檢測(cè)染色體數(shù)目異常如三體、單體等。

染色體臂或整條染色體涂染探針（WPP探針）：用于檢測(cè)染色體易位和標(biāo)記染色體。

序列特異性探針（GLP探針）：包括臂、帶和基因探針等多種，

用于檢測(cè)基因缺失和重排。

除此之外，常用的還有亞端粒探針，靠近端粒的200-300Kb為染色體特異性DNA，用于檢測(cè)涉及端粒的隱匿性易位。

在講應(yīng)用之前，先來(lái)夸一下FISH平臺(tái)，F(xiàn)ISH技術(shù)有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：安全、快速、靈敏度高；探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。

近幾年已有100種腫瘤基因FISH探針用于臨床，因此，在分子檢測(cè)平臺(tái)中地位越發(fā)重要。首先來(lái)看一下可用FISH技術(shù)檢測(cè)的基因異常形式，包括基因擴(kuò)增、基因斷裂、基因缺失和基因融合。“金標(biāo)準(zhǔn)”是檢測(cè)平臺(tái)都很希望被冠上的榮譽(yù)稱號(hào)，F(xiàn)ISH技術(shù)當(dāng)仁不讓，它是某些基因異常檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，如乳腺癌的HER-2基因檢測(cè)，肺癌的ALK基因檢測(cè)等。

（一）“金標(biāo)準(zhǔn)”之HER2基因檢測(cè)

一般采用DNA染料SYBR? Green I，染料能夠與雙鏈結(jié)合，發(fā)出熒光，它自身也會(huì)發(fā)出微弱的熒光，應(yīng)用體系內(nèi)所有熒光的信號(hào)強(qiáng)度與DNA量成正比，所以它對(duì)模板沒有選擇性，且不需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的探針，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。但是也因此暴露缺陷，染料能與所有雙鏈DNA結(jié)合，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增和引物二聚體也會(huì)被檢測(cè)出，并干擾結(jié)果。有缺陷就有補(bǔ)救的方法，溶解曲線的分析能幫助操作者判斷產(chǎn)物的特異性，溶解曲線是指隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。單一峰的溶解曲線說明擴(kuò)增特異性好，有雙峰代表出現(xiàn)了非特異擴(kuò)增或引物二聚體。

一般而言，乳腺癌患者首選做免疫組化，免疫組化2+的患者，仍然存在23.3%的患者HER2基因擴(kuò)增，而此類人群亦能受益于赫賽?。ㄇ字閱慰梗┑劝邢蛩幬铮仨氁僮鯢ISH。3+的不用做FISH，可以直接用靶向輔助治療。0、1+的患者若經(jīng)濟(jì)條件許可，可以建議做FISH。

最后來(lái)看一下FISH做出來(lái)的結(jié)果圖，左邊是HER2擴(kuò)增陰性右邊是陽(yáng)性，HER2檢測(cè)過程中常用到兩種探針，著絲粒探針是檢測(cè)著絲粒觀察對(duì)應(yīng)染色體的個(gè)數(shù)，外加目的探針直接檢測(cè)目的基因HER2，通俗的講，陰性結(jié)果就一個(gè)著絲粒一個(gè)HER2基因，陽(yáng)性就是一個(gè)著絲粒很多個(gè)HER2基因。

另外，ASCO會(huì)議指出晚期胃癌患者在確診時(shí)都應(yīng)接受HER2檢測(cè)，而FDA于2010年10月批準(zhǔn)Herceptin聯(lián)合其他化療藥物用于HER2陽(yáng)性的胃癌和胃食管交界處腺癌患者的治療。

（二）“金標(biāo)準(zhǔn)”之ALK基因檢測(cè)

認(rèn)識(shí)ALK：是一種間變性淋巴瘤激酶（Anaplastic Lymphoma kinase, ALK），強(qiáng)力致癌驅(qū)動(dòng)基因。EML4-ALK基因重排（又叫ALK陽(yáng)性）的肺癌是主要發(fā)生在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），約占肺癌3%-5%。

FDA 2011年批準(zhǔn)克唑替尼上市，適應(yīng)癥為用于治療間變淋巴瘤激酶（ALK）陽(yáng)性的局部晚期或轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌，同時(shí)伴隨批準(zhǔn)雅培Vysis的ALK FISH產(chǎn)品上市。

*使用ALK斷裂探針的NSCLC FISH圖