今天給大家介紹一篇MYC介導(dǎo)的生物鐘破壞與腫瘤增殖相關(guān)的文章，由來自美國貝勒醫(yī)學(xué)院的Eveline Barbieri課題組在Nature Communication上發(fā)表，題為“Restoration of the molecular clock is tumor suppressive in neuroblastoma”，該研究發(fā)現(xiàn)生物鐘的恢復(fù)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中具有腫瘤抑制作用。
——背景——
MYC 家族成員（例如，MYC 和 MYCN）的異常表達(dá)導(dǎo)致許多癌癥的發(fā)生，然而，其直接靶向藥物具有很大的研發(fā)難度。MYCN 癌基因在幾乎一半的高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤 (NB) 中過度擴(kuò)增，并且是驅(qū)動(dòng)這種惡性腫瘤的主要癌基因。目前已有研究發(fā)現(xiàn)MYC和生物鐘調(diào)控之間存在諸多關(guān)聯(lián)，比如MYC/Max復(fù)合物可以結(jié)合到生物鐘基因的啟動(dòng)子上，從而破壞晝夜節(jié)律，并介導(dǎo)異常代謝。在這項(xiàng)研究中，作者針對(duì) MYCN 介導(dǎo)的時(shí)鐘的失調(diào)是否具有功能意義，以及恢復(fù)時(shí)鐘的正臂是否會(huì)干擾這種失調(diào)展開研究。
——結(jié)果——
在MYCN擴(kuò)增的腫瘤患者中時(shí)鐘基因表達(dá)發(fā)生改變，預(yù)示著不良的臨床結(jié)果
為了確定 MYCN 調(diào)節(jié)生物鐘的潛在臨床相關(guān)性，作者分析了在人類原發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤中主要時(shí)鐘蛋白 (BMAL1) 及其激活因子 (RORα) 和抑制因子 (REV-ERBα)的表達(dá)與其臨床結(jié)果和 MYCN 擴(kuò)增的相關(guān)性。對(duì)患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier 分析發(fā)現(xiàn)，RORα和BMAL1 ( ARNTL )高表達(dá)與良好的臨床結(jié)果和分期密切相關(guān)，而REV-ERBα ( NR1D1 )高表達(dá)與不良結(jié)果和分期相關(guān)（圖 1），時(shí)鐘的陽性臂可能為潛在的腫瘤抑制因子。值得注意的是，在 MYCN 擴(kuò)增（MNA）NB 中， RORα和BMAL1的表達(dá)都受到強(qiáng)烈抑制，這與所有患者中較差的總生存期 (OS) 和無進(jìn)展生存期 (PFS) 相關(guān)?？偟膩碚f，時(shí)鐘正臂 ( RORα-BMAL1 )的低表達(dá)定義為 NB 中不利的預(yù)后標(biāo)志物。
圖1 時(shí)鐘基因的表達(dá)在早期NB中改變并與其不良預(yù)后相關(guān)
MYCN通過直接與時(shí)鐘基因啟動(dòng)子結(jié)合而破壞分子時(shí)鐘
由于患者的晝夜節(jié)律基因與 MYCN 表達(dá)之間存在顯著關(guān)聯(lián)，接下來作者繼續(xù)檢測(cè) MYCN 是否可以改變時(shí)鐘基因的表達(dá)。作者采用 MYCN3 (Tet-ON) 細(xì)胞系條件性過表達(dá) MYCN，并在 LAN5 MNA 細(xì)胞系 (LAN5 ShMYCN) 中有條件地沉默 MYCN。發(fā)現(xiàn) MYCN 過表達(dá)導(dǎo)致晝夜節(jié)律抑制因子 REV-ERBα的顯著上調(diào)，以及晝夜節(jié)律激活因子RORα和BMAL1的下調(diào)。然而，MYCN 的沉默完全恢復(fù)了它們的表達(dá)水平（圖2a）。這證實(shí)了 MYCN 在改變晝夜節(jié)律基因表達(dá)方面的作用，特別是抑制時(shí)鐘的正臂。
隨后作者繼續(xù)檢測(cè)MYCN 是否也會(huì)破壞晝夜節(jié)律，選用帶有Per2-luc報(bào)告基因的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)發(fā)光分析，發(fā)現(xiàn) MYCN 誘導(dǎo)還通過延長晝夜節(jié)律和降低晝夜節(jié)律幅度破壞晝夜節(jié)律振蕩。隨后作者繼續(xù)探究 MYCN 調(diào)節(jié)時(shí)鐘的機(jī)制，在 MNA 細(xì)胞和 MYCN Tet-OFF(Tet-21/N) 細(xì)胞中進(jìn)行了 MYCN 染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP-qPCR) 分析，其中 MYCN 在 DOX 處理后關(guān)閉。在兩種 MNA 細(xì)胞系中 MYCN 與REV-ERBα、RORα和BMAL1的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合顯著富集。此外，關(guān)閉 MYCN 完全消除了 MYCN 綁定（圖 2c）。這表明 MYCN 通過抑制時(shí)鐘激活因子 RORα 和 BMAL1 并誘導(dǎo)時(shí)鐘抑制因子 REV-ERBα破壞時(shí)鐘。
圖2 MYCN直接與時(shí)鐘基因啟動(dòng)子結(jié)合，并下調(diào)時(shí)鐘的正臂
RORα拯救了MYCN介導(dǎo)的對(duì)BMAL1表達(dá)和振蕩的抑制
接下來作者采用RORα藥理學(xué)激活（通過激動(dòng)劑SR1078）方法測(cè)試RORα信號(hào)在NB細(xì)胞中是否活躍，用SR1078處理兩種MNA細(xì)胞系（LAN5和SK-N-BE），并測(cè)定RORα靶基因的mRNA表達(dá)，SR1078有效激活兩種細(xì)胞系中的靶基因轉(zhuǎn)錄（圖3a）。此外，SR1078有效地誘導(dǎo)了兩個(gè)系統(tǒng)中的BMAL1蛋白表達(dá)（圖3b）。
隨后作者繼續(xù)探究 RORα 過表達(dá)是否可以挽救 MYCN 介導(dǎo)的 BMAL1 表達(dá)和振蕩抑制。為此，作者采用了兩種誘導(dǎo)型 MYCN 細(xì)胞系統(tǒng)：MYCN3 (Tet-ON) 和 SK-N-AS MYCN-ER 細(xì)胞。正如所料，所有已知和已鑒定的 MYCN 靶基因（ODC1、REV-ERBα、DKC1、RORα 和 BMAL1）在開啟 MYCN 后均被顯著誘導(dǎo)或抑制。值得注意的是，在 MYCN 激活后，兩個(gè)系統(tǒng)中的 BMAL1 mRNA 和蛋白質(zhì)水平都受到抑制。然而，SR1078 處理（ROR激動(dòng)劑）能夠完全挽救 BMAL1 mRNA 和蛋白質(zhì)水平（圖3c）。此外，MYCN-ER（MYCN-ON）極大地?fù)p害了SK-N-AS MYCN-ER細(xì)胞中BMAL1的晝夜節(jié)律振蕩。然而，RORα的過度表達(dá)既能恢復(fù)BMAL1的表達(dá)，又能完全恢復(fù)其晝夜節(jié)律振蕩（圖3d）。
圖3 RORα激活拯救了MYCN介導(dǎo)的對(duì)BMAL1表達(dá)和振蕩的抑制。
RORα激活恢復(fù)BMAL1表達(dá)并抑制腫瘤細(xì)胞生長
因?yàn)?/span> MYCN 對(duì)時(shí)鐘的抑制與不良的臨床結(jié)果相關(guān)，隨后作者繼續(xù)分析通過激活 RORα 恢復(fù)時(shí)鐘是否具有功能意義并改變 NB 細(xì)胞表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SR1078 抑制 MNA 和非 MNA 細(xì)胞系的細(xì)胞生長。然而，與非 MNA 細(xì)胞相比，這種效應(yīng)在 MNA 中更大。類似地，MNA 細(xì)胞在 SR1078 處理后顯示出更強(qiáng)的半胱天冬酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡活性（圖 4a）。RORα（RORα Tet-ON）的過表達(dá)也極大地限制了細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯（圖 4b）。然而，BMAL1 的消耗促進(jìn)細(xì)胞生長并幾乎消除了由 SR1078 和 RORα 過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞活力阻滯和細(xì)胞凋亡（圖 4c），表明 RORα 的抗腫瘤活性依賴于 BMAL1。
圖4 RORα激活通過BMAL1抑制細(xì)胞存活
RORα的激活使NB腫瘤對(duì)常規(guī)化療敏感
接下來作者繼續(xù)探究通過激活ROR恢復(fù)分子時(shí)鐘是否可以使 NB 對(duì)常規(guī)治療敏感。測(cè)試SR1078 是否會(huì)改變 NB 細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)療法如依托泊苷 (VP16) 的敏感性，當(dāng)用聯(lián)合療法處理細(xì)胞時(shí)，VP16 IC50值顯著降低（LAN5、IMR32 和 NGP 細(xì)胞分別為 10.3、4.2 和 10.3 倍），SR1078 IC50值也顯著降低（分別為 13.6、29 和 40 倍）（圖 5a）。此外，在三種細(xì)胞系中，低劑量 SR1078 的加入增強(qiáng)了 VP16 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖 5a）。隨后，作者使用由 MNA NGP 細(xì)胞產(chǎn)生的原位異種移植物在體內(nèi)測(cè)試了聯(lián)合療法的抗腫瘤活性。正如預(yù)期的那樣，單一藥物 SR1078 和 VP16 顯著阻斷腫瘤生長（p ?< 0.05），SR1078 使增強(qiáng)了NB 腫瘤對(duì)VP16的敏感性（p ?= 0.0031）（圖 5b），表明調(diào)節(jié)時(shí)鐘可能是一種可行的治療方法。
圖5 SR1078使NB對(duì)常規(guī)化療敏感
——小結(jié)——
本文發(fā)現(xiàn)分子時(shí)鐘主要調(diào)節(jié)因子的表達(dá)在 MYCN 擴(kuò)增的 NB 患者中被嚴(yán)重破壞，這種破壞導(dǎo)致了不良的臨床結(jié)果。MYCN 通過下調(diào)時(shí)鐘激活因子和誘導(dǎo)時(shí)鐘抑制因子來衰減 NB 中的時(shí)鐘。而通過激動(dòng)劑 SR1078 激活RORα 的活性恢復(fù)時(shí)鐘可以有效阻斷 MYCN介導(dǎo)的腫瘤生長，并使 NB 腫瘤對(duì)常規(guī)化療敏感。總之，阻斷由 MYCN介導(dǎo)的分子時(shí)鐘和細(xì)胞代謝失調(diào)，促進(jìn)RORα 的重新激活可以作為 MYCN 擴(kuò)增型神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療策略。
參考文獻(xiàn)：
[1] Moreno-SmithM, Barbieri E, et al. Restoration of the molecular clock is tumor suppressive in neuroblastoma. Nat. Commun. 2021,12(1):4006.
doi:10.1038/s41467-021-24196-4.
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