[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是一種高通量檢測探針及其熔解曲線檢測方法及其應(yīng)用。
[0002]目前，熒光PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳變異、腫瘤突變和微生物的檢測。探針熔解曲線技術(shù)又稱為后PCR技術(shù)，利用能與靶核酸序列特異性結(jié)合的檢測探針，在擴增程序后加上一個熔解程序，通過逐漸提高溫度，使熒光標(biāo)記探針與靶核酸形成的雙鏈發(fā)生熔解，形成一個具有特定熔點(Tm值)的熔解峰，根據(jù)熔點的不同可對多個靶核酸進(jìn)行區(qū)分。分子信標(biāo)探針是熔解曲線常用的一種，其他的還有線性雙標(biāo)記探針、單標(biāo)記探針、非標(biāo)計探針等。分子信標(biāo)探針由莖區(qū)域和環(huán)區(qū)域組成，環(huán)區(qū)域是與靶核酸特異結(jié)合區(qū)，莖區(qū)域為人為添加的高GC序列，無靶核酸存在時，因其具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形式，熒光基團與淬滅基團相互接觸，熒光本底很低，特異性好。分子信標(biāo)探針雖然優(yōu)勢突出，但是其檢測通量較低，靈敏度不高，而且當(dāng)兩個靶標(biāo)序列的熔點小于4時，很容易形成融合峰，無法判斷具體是哪一種靶核酸；市場需要一種各熔解峰均能獨立存在，不產(chǎn)生融合，區(qū)分效果佳的熔解曲線檢測方法，本發(fā)明解決這樣的問題。
[0003]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于本發(fā)明提供了一種高通量檢測探針及其熔解曲線檢測方法及其應(yīng)用，本發(fā)明的檢測探針的熔解曲線檢測方法能夠達(dá)到高通量檢測，單個通道就可以同時檢測8個及以上的靶核酸，形成特定Tm值的熔解峰，各個靶核酸的熔解峰之間相差2至6℃，各熔解峰均能獨立存在，不產(chǎn)生融合，區(qū)分效果佳。
[0004]為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0005]一種高通量檢測探針，檢測探針的5’端標(biāo)記熒光標(biāo)記物，3’端進(jìn)行封閉；3’端具有靶特異結(jié)合序列Ⅰ，5’端具有尾巴序列；尾巴序列包括：前3?5個為GC序列，GC序列后是靶特異結(jié)合序列Ⅱ，靶特異結(jié)合序列Ⅱ的長度為8?25nt，Tm值為45?55℃；靶特異結(jié)合序列Ⅱ與擴增子下游的一段序列一致，擴增子下游序列位于檢測探針與下游引物之間；
[0006]靶特異結(jié)合序列Ⅰ在第一輪擴增時與靶核酸結(jié)合，靶特異結(jié)合序列Ⅱ在第一輪擴增時被酶切，形成第二輪延伸的引物。
[0007]一種高通量檢測探針的熔解曲線檢測方法，包括如下內(nèi)容：
[0008]設(shè)計高通量檢測探針，
[0009]5’端標(biāo)記熒光標(biāo)記物，3’端進(jìn)行封閉；3’端具有靶特異結(jié)合序列Ⅰ，5’端具有尾巴序列；尾巴序列包括：前3?5個為GC序列，GC序列后是靶特異結(jié)合序列Ⅱ，靶特異結(jié)合序列Ⅱ的長度為8?25nt，Tm值為45?55℃；靶特異結(jié)合序列Ⅱ與擴增子下游的一段序列一致，擴增子下游序列位于檢測探針與下游引物之間；
[0010]進(jìn)行第一輪擴增，
[0011]5’端尾巴序列的靶特異結(jié)合序列Ⅱ在第一輪擴增時被酶切，3’端暴露出羥基，可作為第二輪延伸的引物，下游引物的5’端引入GC序列和4至6個C堿基；
[0012]進(jìn)行第二輪擴增，
[0013]在第二輪延伸結(jié)束之后，探針形成類似發(fā)卡結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針，分子信標(biāo)的莖區(qū)域由探針尾巴序列中的GC序列和下游引物5’的GC序列的互補序列組成，探針的3’端被加入4?6個G堿基，對探針的熒光標(biāo)記物起到淬滅作用；
[0014]探針與靶核酸下游序列匹配、發(fā)生熔解，形成特定Tm值的熔解峰，根據(jù)探針的5’尾巴序列的堿基組成或與擴增子下游區(qū)域的延伸長度設(shè)計使得各個靶核酸的熔解峰之間相差2至6℃；
[0015]合成檢測對象的質(zhì)粒模板，經(jīng)過PCR，上機檢測。
[0016]前述的一種高通量檢測探針的熔解曲線檢測方法，根據(jù)探針的5’尾巴序列的堿基組成調(diào)節(jié)熔解峰Tm值的具體方法為：調(diào)整探針5’尾巴序列的GC含量，具體通過選擇合適的靶特異結(jié)合序列Ⅱ在第一輪擴增子上的結(jié)合區(qū)，結(jié)合區(qū)的GC含量越高，Tm值越高。
[0017]前述的一種高通量檢測探針的熔解曲線檢測方法，根據(jù)擴增子下游區(qū)域的延伸長度調(diào)節(jié)熔解峰Tm值的具體方法為：探針的靶特異結(jié)合序列Ⅱ與第一輪擴增子下游區(qū)域的延伸產(chǎn)物長度越長，Tm值越高。
[0018]前述的一種高通量檢測探針的熔解曲線檢測方法，采用多色熒光標(biāo)記，利用多通道檢測，每個通道檢測至少8個靶核酸。
[0019]前述的一種高通量檢測探針的熔解曲線檢測方法，檢測探針的5’端標(biāo)記的熒光標(biāo)記物包括：FAM、HEX、ROX、Cy5。
[0020]前述的一種高通量檢測探針的熔解曲線檢測方法，檢測探針的3’端標(biāo)記的淬滅基團包括：BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB。
[0021]一種高通量檢測探針的應(yīng)用，用于檢測多個靶序列突變。
[0022]前述的一種高通量檢測探針的應(yīng)用，檢測人乳頭瘤病毒靶核酸的方法包括如下內(nèi)容：
[0023]人乳頭瘤病毒的8種高危型靶序列包括：HPV16、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV66；
[0024]使用通用引物HPV?F和HPV?R進(jìn)行擴增，序列如SEQ NO.01、SEQ NO.02；
[0025]在8種高危HPV型的保守區(qū)設(shè)計檢測探針，序列如SEQ NO.03、SEQ NO.04、SEQ NO.05、SEQ NO.06、SEQ NO.07、SEQ NO.08、SEQ NO.09、SEQ NO.10，熒光基團標(biāo)記在5’端，探針的5’端尾巴序列包含GC序列和一段與擴增子下游一致的序列，GC序列作為分子信標(biāo)的一個莖，與擴增子下游一致的序列在第一輪擴增時被Taq DNA聚合酶切掉，作為第二輪延伸的引物進(jìn)行延伸，下游引物的5’端引入GC序列和4至6個C堿基，GC序列在第二輪延伸后得到互補的GC序列，作為分子信標(biāo)的另外一個莖，4至6個C堿基可在上游引物延伸時在其3’端添加4至6個G堿基，在第二輪延伸之后，檢測探針形成類似發(fā)卡結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針；
[0026]分子信標(biāo)探針利用多個G堿基對探針的熒光進(jìn)行淬滅，在后續(xù)的熔解程序中，分子信標(biāo)探針與擴增子發(fā)生熔解，形成特定Tm值的熔解峰，根據(jù)探針的5’尾巴序列的堿基組成或與擴增子下游區(qū)域的延伸長度設(shè)計使得各個靶核酸的熔解峰之間相差2至6℃；
[0027]人工合成以上8種HPV型別的質(zhì)粒模板，經(jīng)過PCR，上機檢測。
[0028]本發(fā)明的有益之處在于：
[0029]本發(fā)明檢測探針通過探針5’端尾巴序列引入分子信標(biāo)探針的一個莖，同時通過下游引物5’端GC序列再引入分子信標(biāo)另一個莖和4?6個游離的G堿基，4?6個游離的G堿基能發(fā)揮良好的淬滅作用；
[0030]根據(jù)探針的5’尾巴序列的堿基組成和與擴增子下游序列的延伸長度來調(diào)節(jié)Tm值，同時探針可使用多色熒光基團標(biāo)記，利用多通道從而達(dá)到更高通量的檢測目的，單個通道可以檢測8個及以上的靶核酸；
[0031]本發(fā)明使用的檢測探針，在第一輪擴增時，其靶序列特異性結(jié)合序列Ⅰ與靶核酸特異結(jié)合，此時靶序列特異性結(jié)合序列Ⅱ被酶切，形成第二輪延伸的引物，通過兩次特異性結(jié)合，增強了檢測特異性，形成更窄的熔解峰，提高了通道利用效率，也同時提高了檢測靈敏度。
