文 | 杭興宜
編者按：本文根據(jù)艾吉泰康生物科技CEO杭興宜7月28日在貝殼社北京“搶占千億級的精準醫(yī)療市場”主題沙龍上的演講整理，題目為《靶向捕獲測序在精準醫(yī)療中的應用》。
首先感謝貝殼社，應邀來講講基因測序在精準醫(yī)療中的發(fā)展和應用?；驕y序，從實時定量PCR，到一代測序、二代測序，整個范圍比較廣。如果要講，只能像剛才田埂博士所闡述的對產(chǎn)業(yè)鏈先做一個梳理，然后選其中一個點來交流。艾吉泰康是在基因檢測產(chǎn)業(yè)鏈上，基于基因捕獲技術，提供基因檢測panel的設計和開發(fā)服務。所以今天跟大家分享的是靶向捕獲測序在精準醫(yī)療中的應用。
今天我主要講四個部分，第一部分想跟大家分享一下精準醫(yī)療的發(fā)展，以及靶向捕獲在其中的一些應用場景。第二部分從技術原理的角度與大家做一些探討。第三部分是一些具體的案例，還有一些質量控制和臨床的分析的方法。最后是服務模式的交流。
精準醫(yī)療與靶向捕獲
現(xiàn)在大家有一種印象，好像精準醫(yī)療是奧巴馬提出的一樣，其實往前溯源，個體化醫(yī)療、轉化醫(yī)學都屬于精準醫(yī)療的前身。
西方的醫(yī)學史里，1940年馬里蘭州的一個醫(yī)生就提出了精準醫(yī)療的理念。這讓我想起了小時候看《動物世界》，每到遷徙季，西非大草原上很多斑馬成群結隊的在那兒遷徙，我們一眼望去每匹斑馬都是一樣的。但是實際上你走近了就會發(fā)現(xiàn)每匹斑馬的紋路甚至是色彩都是唯一的。這就是精準醫(yī)療的核心，每一個患者，每一個個體他們都是唯一的。
再往前，在我國也有一些精準醫(yī)療理論的始祖。東漢時期張仲景在《傷寒雜病論》就提出了辯證論治，這是一個精準醫(yī)療理論的核心，每個病例要有不同的客觀地治療方法。直到2015年奧巴馬才走上這個講臺，跟大家說精準醫(yī)療是美國的國家戰(zhàn)略。然后我們國家緊接著三月份就召開了精準醫(yī)療戰(zhàn)略專家會議，準備2030年前投入600億。十二月份衛(wèi)計委就制定了精準醫(yī)療戰(zhàn)略規(guī)劃，十三五的重大專項。在去年年底的時候，幾乎有三分之一的省份都陸續(xù)啟動了各個省級的精準醫(yī)療計劃。今年三月份的時候科技部也發(fā)布了精準醫(yī)療的重大專項。
可以說，精準醫(yī)療從醫(yī)學史上和醫(yī)學理論上有很長的歷史，但為什么到2015年才真正的像雨后春筍一樣走進我們的視野？
NIH（美國國立衛(wèi)生研究院）認為，三個技術的飛速發(fā)展，推動了精準醫(yī)療的爆發(fā)。第一個就是基因測序技術，這個主要是以二代測序為代表的基因檢測，它無論從速度、準確度還有成本，都呈現(xiàn)了指數(shù)級的下降。這里面也有基因捕獲技術的推動作用，以及液體活檢技術的發(fā)展，使精準醫(yī)療時機越來越成熟。第二就是生物信息技術，包括云計算，數(shù)據(jù)整合分析方法，對數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)解讀的推進。第三個也是現(xiàn)在非?；钴S的人工智能，讓我們的分析能夠更加智能，可以發(fā)現(xiàn)很多新的東西，學習到新的規(guī)律做基因的預測。
緊接著剛才說述，基因測序技術是精準醫(yī)療的基礎技術和推動力之一，那它又經(jīng)過了怎樣的一個發(fā)展歷程？最早是人類基因組計劃，十幾個國家，花了十幾億美元做了好多年。測序越來越成熟以后，全基因組測序越來越方便，在不同的物種里面都取得了大量的數(shù)據(jù)積累。再往前進一步縮小一下范圍，我們對全部的基因編碼區(qū)進行測序，也就是耳熟能詳?shù)牡耐怙@子測序。其實外顯子測序也是基因捕獲的一種，只是把所有基因編碼區(qū)進行了富集。最后再精準一點目標，就是目標區(qū)域捕獲測序，它對特定應用場景中任何的基因，或者基因片段，甚至可以是非編碼區(qū)域的，包括一些熱點進行設計，然后開發(fā)出用來特定基因檢測的panel。
二代測序大約是2006年真正地進入了應用，當時最早是Roche 454焦磷酸測序系統(tǒng)。我第一次看到靶向測序是2008年，當時是基于固相芯片上合成的探針，作為外顯子捕獲的產(chǎn)品?？梢园l(fā)現(xiàn)靶向測序的技術提供商，實際上最早是從芯片服務提供商演變而來的。大概09年的時候，安捷倫公司也推出了他們的外顯子捕獲的產(chǎn)品。其實大家可以從安捷倫的前身來看，最早是HP，核心技術是高精度激光打印，還有一些生化儀器都非常好。他也有他的芯片制造平臺，也是從固相芯片的技術上發(fā)展上來的。
然后大概在2011年，國內(nèi)的一些研究人員，包括我們當時也大概在那個時間點開始研究。比如說我們在研究這些探針引物的設計，或者說這些試劑的配比，并在2014年時能夠對外提供產(chǎn)品和服務。在這個技術上中國跟國外比來說，落后大概6年左右。并在2015年時形成正式的試劑盒產(chǎn)品。
另一個時間軸是講另外一類捕獲技術，“多重PCR”的發(fā)展歷史。1988年Chamberian提出PCR體系加入多對特異性引物，出現(xiàn)了多重PCR體系的雛形。然后在2005年左右的時候Life Technologies (Thermo Fisher Scientific)推出了他們的高通量測序平臺，同時這個平臺在07年就開始嘗試測序儀的對接。然后在2010年的時候，他們推出來了Ion Torrent的平臺，也推出了Ion AmpliSeq捕獲的產(chǎn)品。我們從2013年研發(fā)，也是在2015年的時候正式的推出了基于擴增子捕獲的產(chǎn)品和服務。
當然從國際上來看，這個領域的大部分核心技術提供商還是在美國及歐洲。有四家美國企業(yè)，有一個是羅氏收購的一家企業(yè)。在捕獲測序的應用不一一列舉，這是選了幾個重要的點。可以說在精準醫(yī)療大部分的應用場景中，捕獲測序都有它的用武之地，可以是腫瘤的預警、用藥、篩查，也可以遺傳病的診斷，也可以是產(chǎn)前的疾病篩查，以及我們大眾健康的產(chǎn)品，就是前面郝向穩(wěn)先生重點介紹的一些應用。
上圖是我們的一些經(jīng)驗，是在精準醫(yī)療上的應用的一些深度、數(shù)據(jù)量覆蓋度的狀況。做全基因組測序的時候，其實一般的情況下只能測三十層，但是在我們臨床檢測當中的時候，要求精準度、靈敏度比較高，這個測序深度是遠遠不夠的。但是如果我也測很深，這個成本在商業(yè)場景中是不可負擔的。
然后，全外顯子常規(guī)的現(xiàn)在測序一般一百層，在腫瘤的一些樣本當中可能會測到三百到五百層，但是這個測序成本也比較高。
腫瘤組織的捕獲測序一般是測一千層，能獲得大概5G的數(shù)據(jù)。Panel的覆蓋度，在一般的編碼區(qū)都能占到99%以上。液體活檢可能要測到一萬層，因為它對靈敏度要求非常高。像遺傳病的話，按照我們的經(jīng)驗兩百層到三百層的深度就能夠做到準確檢測，因為它測的就是遺傳突變。腫瘤樣品異質性強，要測體細胞突變，所以測序深度要求更高。
靶向測序在精準醫(yī)療當中應用的價值是什么呢？第一相對來說檢測的靶點多，這個大家都是承認的。第二就是現(xiàn)在的二代測序儀與試劑盒的操作，以及整個流程運轉還是很快的，你要是快速測序也就幾天就能出結果。第三就是準確靈敏。一般傳統(tǒng)意義上認為測序是金標準。當測序深度，包括田埂博士他們做的一些技術提高了以后，靈敏度能到百萬分之一。對于靶向測序來說最大的優(yōu)勢是成本低，精準醫(yī)療核心是要精準，在臨床樣品中必須達到一定測序深度才能實現(xiàn)精準。
在價值引導上，我覺得最重要的有兩點，就是我們現(xiàn)在在國內(nèi)做這件事。第一其實在靶向捕獲核心技術，你會不太清楚里面的技術參數(shù)，從而不能建立這個環(huán)節(jié)的標準。比如說我們?nèi)笈臅r候這些參數(shù)用戶并不清晰，和國外企業(yè)合作需要付出極大的成本才能獲得參數(shù)標準及聯(lián)合報批的可能性。第二就是自主開發(fā)能夠助于這個項目落地，無論是你在臨床送樣檢測，還是做成一個解決方案去做入院，都會包含基因捕獲的這個重要環(huán)節(jié)，門檻降低才會方案落地。
捕獲技術是精準醫(yī)療的基礎性技術
第二個部分可能是偏技術類的，我們認為基因捕獲技術是精準醫(yī)療里面的基礎性技術之一，大部分應用場景都會涉及。做一個比喻，大家看到《三國演義》趙子龍千軍之中把阿斗給救出來。我們這個有幾個過程剛好十分相像。
第一個就是目標區(qū)域識別。那么趙子龍在陣前，那么多的曹軍在那兒，我又看不到阿斗在哪兒，帶回來一個阿貓阿狗肯定不行是吧。所以說第一步是目標區(qū)域的識別，這個里面我們把趙子龍，就把這個探針引入。第二個目標區(qū)域，我們想要檢測的精準目標就是那個阿斗。那么非常嘈雜的背景，因為曹軍太多了，當時號稱有十萬曹軍，整個基因組片段打碎以后很多很多，怎么樣特異性的把這個給識別出來，這是一個很好的技術問題。
現(xiàn)在在基因捕獲這一塊主要應用的方法有兩類。一個是液相芯片，基于探針雜交的方法，一個是擴增子也叫多重PCR，它大概有不同的應用區(qū)域能夠結合起來滿足市場上90%以上的應用需求。
液相雜交適合于相對比較連續(xù)的長的片斷，特別是對大片段的插入缺失、拷貝數(shù)變異以及基因融合現(xiàn)象的捕獲。而且在大片段捕獲時液相芯片的均一性比較穩(wěn)定。當然它的缺點是什么呢？它的操作步驟還是比較多，雜交過夜的話還要兩天，不過我們現(xiàn)在也在研發(fā)這個新的技術，看看這個時間能不能再縮短一點。
擴增子的技術也叫多重PCR，其實核心原理是PCR擴增以后直接測序，省去了建庫的步驟。擴增子比較適合于熱點檢測，或者比較小一點的片段捕獲。比如說我們能做到幾百重或者上千重的擴增子。它的優(yōu)點比較快速，屬于快速檢測的一類。第二成本相對比較低。缺點是基因熱點特別多，或者捕獲區(qū)域比較長的時候，獲得的數(shù)量越多，引物的競爭性越強，這個產(chǎn)品的研發(fā)還有它的特異性非常的難保證。液相芯片實驗周期還是比較長的，兩到三天。擴增子三到五個小時，這是試用的一些范圍。
捕獲技術的關鍵無非是幾個點，第一就是目標區(qū)域的識別，第二是目標區(qū)域的捕獲，第三目標區(qū)域的回收和解析。識別的關鍵是探針和引物的設計。我們是自主開發(fā)的多參數(shù)的模型，經(jīng)過近百個panel開發(fā)的磨練和數(shù)據(jù)反饋，才能把這個模型給優(yōu)化出來。
第二，捕獲需要根據(jù)設計的最優(yōu)結果進行實驗。首先通過我們自主開發(fā)的算法進行探針或引物設計。比如，大家要打一個家具，工匠們一般也是先用CAD畫圖，然后再做木工工藝。同理，捕獲在實驗過程中，也是包括多步驟，多個工藝的過程，你會發(fā)現(xiàn)做出來的結果不一定和設計的結果完全一致，所以后續(xù)還會有調整優(yōu)化的過程，我們把這個過程叫做再平衡。再平衡其實里面有很多方向性技巧，沒有做過大量的實驗的話，第一時間是摸不到那個門路的。我們?yōu)槭裁茨軌蛟趪鴥?nèi)提供快速的訂制開發(fā)服務，確實因為積累的經(jīng)驗能夠支撐我們能夠實現(xiàn)快速優(yōu)化，能在極有限的時間內(nèi)把高品質產(chǎn)品交付出來。
解析呢，我們把它理解為一個質控的過程。就是我們經(jīng)過設計、實驗然后測序。測序完了以后我們看結果中覆蓋度、均一性還有捕獲效率等等，是否達到了應用的要求。同時還有一些其它的質控標準，但這三個指標是基因捕獲好壞的核心特質。下圖是探針設計的一些簡單的基本原理，就剛才說的特異性，熱力學穩(wěn)定性曲線，我們每個設計都會出具非常專業(yè)的設計報告，在客戶評估完畢后再根據(jù)需求特異性修訂設計或繼續(xù)向前實驗。
艾吉泰康正在努力打造高通量序列設計引擎。我們自己有些感悟，就是探針引物在設計環(huán)節(jié)都是序列，在高通量的序列特征的分析，或者說設計環(huán)節(jié)當中有很多的共性的東西。包括我們在基因捕獲里面，無論是高通量探針還是引物設計，包括在其它的序列特征提取當中很多規(guī)則是一樣的。所以我們可能會開發(fā)出越來越多的設計的應用，并且做到線上為大家免費提供服務。
實際上在互聯(lián)網(wǎng)的領域，我們把這個定義為一種SaaS服務，就是一種非常專業(yè)的，高通量特征序列提取的一種業(yè)務流程。我們可以和專業(yè)的云計算的PaaS去配合（比如聚道云等），實際上我們今年一直在這個方面努力。因為它不只是一些生物的問題，還牽涉到一些算法優(yōu)化，還有硬件的事，確實花了一些的時間，期待能和更專業(yè)的IT背景的人或企業(yè)合作。在序列設計的領域，當時我們已經(jīng)積累發(fā)表了一批SCI文章和專著，引用率和使用率頗高。
基因捕獲在技術原理上其實特別簡單。液相雜交法中首先將常規(guī)樣本的基因組打斷，然后根據(jù)測序儀器加接頭。我們設計的探針，會跟DNA隨機打斷的片段特異地互補結合，最后通過磁珠把捕獲的目標區(qū)域吸附下來，吸附下來再經(jīng)過洗脫、純化、富集上機測序?？赡懿煌墓驹谶@個里面有些細節(jié)不一樣，但是這些公共步驟都是一樣的。多重PCR就更簡單，實際上它在實驗環(huán)節(jié)中只需經(jīng)過一輪或者兩輪PCR，直接得到產(chǎn)物就上機測序了。這個里面難點還是在設計，以及實驗條件的磨合上，實驗步驟真的是特別簡單。
從解析這個角度上給大家交流一下，里面有哪些關鍵參數(shù)來評判基因檢測的好壞。第一個當然是有目標區(qū)域的測序量，覆蓋度，數(shù)據(jù)的均一性，代表著是它的可信度，也就是準確度。所謂的均一性，形象一點比喻，你看reads的分布圖跟山峰一樣的，有高有低的那肯定就不均勻，在峰底的時候準確度就特別低，峰頂是過度的高。還有一些標準就是重復率、捕獲效率，以及一些常規(guī)的測序質量等等。這個捕獲效率我做了一個公式，講的比較直觀一點。比對到目標區(qū)域的有效數(shù)據(jù)量除以比對到所有的人基因組區(qū)域的有效數(shù)據(jù)量就是捕獲效率。有效數(shù)據(jù)量是什么呢，你測序的時候會有重復率，用1減去這個重復率就是不重復率，不重復的達到QC標準比例再乘以原始數(shù)據(jù)，就是這個有效數(shù)據(jù)。然后平均深度我們是這么定義的，比對到目標區(qū)域的有效數(shù)據(jù)量除以panel區(qū)域的大小來計算平均深度。
重復率這一塊我們的去重標準是非常嚴格的，只允許唯一一條，其它的都叫重復。目前部分企業(yè)篩選標準比較低，允許三條，會對檢測結果造成很大的解讀隱患。下一頁展示的是在panel檢測中可以通過增加測序深度提高準確度，你看在五十層的時候這個是一個純合突變，到三百層的時候就被發(fā)現(xiàn)是雜合突變，明顯表明測序深度能夠部分解決準確度的問題。
靶向捕獲的研究和臨床應用
下面我講一些具體的應用案例。捕獲測序首先在基礎科研上有一些應用，最近我們探索地跟一些研究所在基因組編輯的脫靶效應優(yōu)化上面做的一些合作開發(fā)，然后在單細胞測序上面，經(jīng)過上游的細胞捕獲，然后擴增，下游再接上基因捕獲看看這個數(shù)據(jù)效果怎么樣。
另外像液體活檢ctDNA的這一塊也是比較多的應用。另外其實我們剛才聊了很多的東西都是基于基因組的。舉個案例，就是基因組編輯的定制化的全基因組脫靶優(yōu)化方案，實際上它會有一些目標基因，我們會對這個目標利用靶向測序技術分析它的脫靶效應，看能不能通過靶向測序把它給鑒定出來，然后優(yōu)化實驗的過程。首先它會有一些目標基因，比如說這個案例里面，就是DMD基因。我們會在全基因組范圍內(nèi)預測它的脫靶位點，然后從篩選這些位點進行編輯實驗，實驗結果會通過表型，無論細胞表型還是動物表型去查看。這時候其實還不能確定脫靶位點，然后可以通過把和表型關聯(lián)的預測的這些脫靶位點進行捕獲測序，精確地告訴大家，基因是否在其他的基因組區(qū)域上脫靶了，脫靶的基因型是什么？
另外在臨床基因檢測中應用最多的是SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測，同時其它基因組變異的篩查研究也特別多。我們舉一些案例。這個是一個遺傳病的panel，可以用來發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)的變異，右上直方圖是父親、母親、孩子的拷貝數(shù)體現(xiàn)，能夠發(fā)現(xiàn)顯著的差異，藍色的區(qū)域就是拷貝數(shù)的變化的量，這個能夠確定拷貝數(shù)斷點的位置?；虿东@技術還可以發(fā)現(xiàn)特別大片段基因的缺失，有些常規(guī)的分子生物技術還做不到。
這是展示的胰腺癌的一個樣本中拷貝數(shù)變異，ERBB2的基因擴增是跟很多靶向藥物用藥相關聯(lián)的，有助于協(xié)助醫(yī)生判斷對患者進行異病同治。
這個是我們做的一個panel，發(fā)現(xiàn)中國人群前列腺癌樣本中的基因融合現(xiàn)象，因為基因融合有的時候比較復雜，它的融合點準確位置并不確定，而且有一些文獻報道的也是歐美人群的數(shù)據(jù)。當你不知道這個融合點位置的時候，在設計引物和探針的時候非常困難。實際上這個是發(fā)現(xiàn)了一個比較典型的三基因融合的現(xiàn)象，就是Gene-1、Gene-2，包括這個ETV1的一個3基因的融合，在一代測序上面得到了驗證。
這個是食管癌的panel檢測案例，文獻報道的有一個C1QTNF3-AMACR的基因融合。但是我們還發(fā)現(xiàn)了另外六個新的融合事件。Gene3和MECOM的融合，Gene4和VMP1的融合。這個也是剛才發(fā)現(xiàn)了更多復雜的融合的變異結構，通過生物信息可以把他們的基因的結構給復原出來。
艾吉泰康做了很多上游panel設計和開發(fā)，因此我們對panel基因檢測本身的技術參數(shù)非常了解，我們也發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)內(nèi)現(xiàn)存的一些質控問題。只有做好指控，并對技術指標的解讀標準非常清晰，才能真正做到精準檢測。
基因檢測上游的測序技術，包括基因捕獲技術在國內(nèi)都處于發(fā)展早期和追趕期，行業(yè)標準也沒有形成規(guī)范。我們長期和行業(yè)內(nèi)企業(yè)合作，都是從原始數(shù)據(jù)到生物信息的各個層次的數(shù)據(jù)的整體交付，這樣數(shù)據(jù)質量問題永遠可追溯。跟我們打交道的大部分都是企業(yè)內(nèi)的專業(yè)技術人員，好多像郝向穩(wěn)先生、田埂博士這樣的。他們會第一時間給我們反饋數(shù)據(jù)里面的問題。但是我們在做臨床基因檢測的時候，大部分的企業(yè)都是發(fā)布臨床報告，醫(yī)生并不能發(fā)現(xiàn)其中的數(shù)據(jù)質量上的一些瑕疵。所以需要我們這些從業(yè)者以職業(yè)道德去做好質控，每個技術指標標準都要非常清晰。
其實目前基因檢測市場上還是良莠不齊，有很多由于數(shù)據(jù)質控造成的問題。這個案例就是測序質量的問題，測序質量低不篩除掉直接發(fā)報告導致了假陽性。測序質量不高的只有一個辦法，就是重測。覆蓋率，這個就是panel的問題，捕獲區(qū)域完全沒有覆蓋完整，然后還直接去發(fā)臨床報告，直接認定為陰性就傳遞給醫(yī)生了。我們重新設計了這個panel保證了覆蓋率，發(fā)現(xiàn)覆蓋到的這個區(qū)域應該是陽性結果。這個是測序深度的問題。
剛才說到測序深度不夠的時候，一開始是純合突變，但是增加測序深度你會發(fā)現(xiàn)變成雜合突變了。這個數(shù)據(jù)可信度是指的均一性，當這個均一性不高的時候，我剛才做的一個比喻，它是像山峰一樣，當你剛好你關注的突變點位于這個山峰的谷底的時候，這可能就是一個錯誤的結果，你去拿去驗證，跟它的結果剛好相反。這個均一性，如果一個panel在一層、四層、十層、二十層的時候平均覆蓋度分別是100%、100%、99%、99%這個下降程度，說明這個panel均一性很好，但如果覆蓋度分別是90%、80%、70%、60%這個下降程度時，一般達不到臨床級的應用，到不了95%以上的話可能都是要直接重做的。還有這個重復率的問題，這個結果重復率非常高，這個公司在做生物信息分析的時候的去重率標準放的特別寬，有了三條以上的重復它才去重。就會造成什么呢？他們真實的測序深度是假的，間接地造成了實際上因為重復率比較寬松，給你報告的達到100層了，但實際上才測了30層。30層就回到剛才那個問題，有的區(qū)域可能就不準吧，你測出來也是假陰性，這個機率非常大。所以最好還是在這些指標上要非常清晰的嚴格指控。
精準醫(yī)療基因檢測是否精準？在中國目前還是一個任重而道遠的問題。我們各個環(huán)節(jié)的從業(yè)者必須從技術創(chuàng)新、技術標準、技術質控，到后續(xù)的技術服務上用心去做，打造中國質造，才能達到真正的精準檢測的終極目標。
服務模式探討
我們提了一個概念叫“中國質造”，不光是能生產(chǎn)，最重要的是質量，在醫(yī)療應用場景中，我們技術指標可能達到了99.9%，但那0.01%到患者那兒，對他個體就是100%。這是我們的試劑盒及試劑盒里試劑的組成。過去一年我們和國內(nèi)近80家機構訂制開發(fā)了近一百個panel。
目前相對于那些國際競品，我們現(xiàn)在的技術指標能夠做到跟他們基本上不分伯仲。我們的采購鏈、制造基本都在國內(nèi)，訂制開發(fā)速度比較快，同時試劑盒交付時嚴格質控，同時交付實際捕獲和NGS測序的質控結果。送測檢測服務一般根據(jù)你的時間和不同成本的要求，從兩周到一個月都有相關的服務。第一種就是說試劑和采購，基因列表提出來，我們通過設計開發(fā)質控完了以后，把試劑盒交付給大家，然后通過標準的protocol在自己的實驗室進行操作。第二個合作模式是新技術的合作開發(fā)。就是因為有些產(chǎn)品比較新，確實我們標準服務里沒有，但是我們對任何的產(chǎn)品開發(fā)都是一種比較開放的合作態(tài)度，以技術開發(fā)的形式進行合作。第三就是服務，你也可以送樣服務，目前我們的測序通量還比較大，能夠協(xié)助大家把時間和測序的成本降下來，測序成本優(yōu)勢比較明顯。
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