文章題目：Single-cell multi-omics reveals dyssynchrony of the innate and adaptive immune system in progressive COVID-19
日期：2022年1月21日
期刊：NATURE COMMUNICATIONS
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-27716-4
SARS-CoV-2病毒的免疫反應(yīng)失調(diào)是COVID-19重癥的原因。然而，與免疫病理相關(guān)的免疫信號(hào)知之甚少。在這里，該項(xiàng)研究使用多組學(xué)單細(xì)胞分析來(lái)探討COVID-19穩(wěn)定或進(jìn)展期住院患者的動(dòng)態(tài)免疫反應(yīng)和探索V(D)J庫(kù)，并評(píng)估托珠單抗的細(xì)胞效應(yīng)?；虮磉_(dá)和細(xì)胞系蛋白標(biāo)記的協(xié)調(diào)分析顯示，S100Ahi/HLA-DRlo經(jīng)典的單核細(xì)胞和激活的LAG-3T細(xì)胞是進(jìn)展性疾病的標(biāo)志，并分別強(qiáng)調(diào)了骨系細(xì)胞和T細(xì)胞上MHC-II/LAG-3的異常相互作用。該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)大的效應(yīng)細(xì)胞CD8+ 克隆、未突變的IGHG+ B細(xì)胞克隆和具有穩(wěn)定體細(xì)胞超突變頻率的突變B細(xì)胞克隆中，T細(xì)胞受體儲(chǔ)備出現(xiàn)傾斜?？傊?，該項(xiàng)研究深入的免疫分析揭示了在進(jìn)展期COVID-19中先天和適應(yīng)性免疫相互作用的非同步性。
數(shù)據(jù)已存入GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，號(hào)碼為GSE155224?？梢酝ㄟ^(guò)COVID-19細(xì)胞圖譜數(shù)據(jù)挖掘網(wǎng)站(www.covidcellatlas.com[1])進(jìn)一步研究這些結(jié)果。這個(gè)用戶友好的網(wǎng)站有一個(gè)圖形用戶界面，可以快速可視化scRNA-seq數(shù)據(jù)，用戶可以探索所有細(xì)胞類型中單個(gè)基因或感興趣的基因集的表達(dá)水平，比較COVID-19與對(duì)照組、進(jìn)展期與穩(wěn)定期患者，數(shù)據(jù)集中所有免疫細(xì)胞的早期和晚期時(shí)間點(diǎn)。
在當(dāng)前的研究中，該項(xiàng)研究試圖更深入地了解COVID-19患者在疾病嚴(yán)重程度和疾病病程中的免疫反應(yīng)。為此，采用單細(xì)胞方法研究了10名患者在不同時(shí)間點(diǎn)的18份PBMC樣本。使用年齡和性別匹配的健康受試者(n=13)作為對(duì)照。采用基于液滴的單細(xì)胞平臺(tái)(10x Chromium)進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，以構(gòu)建5’基因表達(dá)文庫(kù)、表面蛋白文庫(kù)(CITE-seq)、T細(xì)胞受體(TCR)文庫(kù)和B細(xì)胞受體(BCR)文庫(kù)。過(guò)濾和清理后153,554個(gè)細(xì)胞被納入scRNA-seq分析。此外，也獲得所有患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室信息，包括病毒載量和細(xì)胞因子組。
樣本來(lái)自穩(wěn)定和進(jìn)展中的COVID-19患者，是耶魯大學(xué)COVID-19 IMPACT(實(shí)施針對(duì)冠狀病毒的醫(yī)療和公共衛(wèi)生行動(dòng))生物庫(kù)的一部分。曾在ICU接受治療并最終死亡的危重患者(n=4)定義為病情進(jìn)展患者，病情穩(wěn)定的重癥患者(n=6)在內(nèi)科病房住院并最終康復(fù)出院。該項(xiàng)研究分析了每個(gè)患者兩份不同血液樣本的PBMCs，早期(A)和晚期(B)時(shí)間點(diǎn)，除了兩個(gè)進(jìn)展期患者(TP8, TP9)，他們只有一個(gè)樣本。根據(jù)臨床參數(shù)，80%的受試者接受了托珠單抗治療。分別取A時(shí)間點(diǎn)和B時(shí)間點(diǎn)處理前和處理后的樣品。對(duì)照組和COVID-19患者的基線特征相似，包括年齡和性別，而歐洲血統(tǒng)的個(gè)體在對(duì)照組中更普遍。進(jìn)展期患者與穩(wěn)定組在基線特征、共病和時(shí)間線方面沒(méi)有差異。進(jìn)展期患者的改良SOFA評(píng)分(一種進(jìn)展期嚴(yán)重程度評(píng)分)明顯更高。
在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在對(duì)照、穩(wěn)定和進(jìn)展樣品中檢測(cè)到特定細(xì)胞類型的相對(duì)豐度的一些差異。進(jìn)展期患者初發(fā)T細(xì)胞(CD4+ 和CD8+ )相對(duì)減少，漿母細(xì)胞和分裂T 和NK細(xì)胞在COVID-19患者與對(duì)照組的對(duì)比增加。干擾素(IFN)激活的CD8+ T細(xì)胞簇是一個(gè)由191個(gè)細(xì)胞組成的簇，其特征是IFN刺激基因(ISGs)的高表達(dá)，幾乎只在COVID-19患者中發(fā)現(xiàn)，特別是在時(shí)間點(diǎn)A中。
經(jīng)典的單核細(xì)胞群亞聚成兩個(gè)不同的群體：一個(gè)是HLA-DR低表達(dá)的群體，這是一種主要組織相容性復(fù)合體(MHC) II類分子，后被稱為S100Ahi/HLA-DRlo單核細(xì)胞。與對(duì)照組相比，COVID-19患者的S100Ahi/HLA-DRlo群集比例較高，這與之前的研究一致。另一方面，非經(jīng)典單核細(xì)胞(標(biāo)記物FCGR3A)在COVID-19中減少，這也與最近的研究一致。COVID-19患者的髓樣樹突狀細(xì)胞(DC)也減少?？傊?，對(duì)穩(wěn)定和進(jìn)展期COVID-19患者在不同時(shí)間點(diǎn)的PBMCs進(jìn)行了全面的圖譜，捕獲了特定細(xì)胞類型相對(duì)豐度的動(dòng)態(tài)變化，反映了免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的反應(yīng)
進(jìn)一步分析了每種細(xì)胞類型的基因表達(dá)變化以及疾病隨時(shí)間進(jìn)程的變化。COVID-19中所有細(xì)胞類型的I型干擾素(IFN-I)反應(yīng)均升高，尤其是在時(shí)間點(diǎn)A，在進(jìn)展期受試者中更是如此。所以在樣本水平上，IFN-I評(píng)分與同期病毒載量之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，與健康對(duì)照組相比，COVID-19患者中所有主要細(xì)胞類型的常規(guī)ISGs，如IFI6、IFI44L、LY6E和ISG15顯著增加。雙調(diào)節(jié)蛋白(AREG)是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的一種配體，不是人類的主要ISG，在健康對(duì)照PBMCs中幾乎檢測(cè)不到，但在COVID-19患者的單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和DCs顯著增加。盡管AREG是在傷口修復(fù)和炎癥解決方面扮演重要角色，但是據(jù)報(bào)道，它的表達(dá)也在肺部的病毒感染中增加并會(huì)在SARS-CoV感染的小鼠模型中誘導(dǎo)嚴(yán)重的肺病。IFN-I信號(hào)通路在小鼠骨髓細(xì)胞AREG誘導(dǎo)中起重要作用。最近一份報(bào)告顯示，COVID-19患者外周血單核細(xì)胞中AREG增加，支持AREG在SARS-CoV-2誘導(dǎo)的肺病理中可能發(fā)揮的作用。
COVID-19疾病的時(shí)間進(jìn)程以許多基因的轉(zhuǎn)移和配體受體相互作用為特征。正如預(yù)期的那樣，所有患者和所有細(xì)胞類型的IFN-I評(píng)分從時(shí)間點(diǎn)A(更早抽血)到時(shí)間點(diǎn)B(更晚抽血)顯著下降，與這些時(shí)間點(diǎn)之間的病毒載量下降相對(duì)應(yīng)。值得注意的是，在A和B時(shí)間點(diǎn)IFN-I得分的下降與它們之間的時(shí)間差異有很強(qiáng)的相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)表明在大多數(shù)患者中，最初升高的IFN-I反應(yīng)隨著時(shí)間的推移和病毒載量的減少而下降。有趣的是，在一些進(jìn)展性患者中，IFN-I反應(yīng)似乎持續(xù)存在，與病毒清除降低相一致。
該項(xiàng)研究觀察到，在所有細(xì)胞系中，穩(wěn)定和進(jìn)展患者之間存在顯著的基因表達(dá)差異。在進(jìn)展患者中，ISGs的表達(dá)在所有細(xì)胞類型中都增加并且骨髓細(xì)胞和其他幾種細(xì)胞類型的抑制性細(xì)胞因子IL10表達(dá)也出現(xiàn)增加。據(jù)該項(xiàng)研究最近的研究以及其他研究報(bào)道，血漿中IL-10水平在嚴(yán)重的COVID-19中升高，并且IFN-I可誘導(dǎo)IL-10表達(dá)，從而在某些條件下限制免疫相關(guān)組織損傷。與ISGs相似，血漿IL-10水平從時(shí)間點(diǎn)A下降到時(shí)間點(diǎn)B，盡管在更大的隊(duì)列患者中，這種下降只出現(xiàn)在穩(wěn)定的非ICU患者中，而在ICU患者中IL-10水平保持較高。該項(xiàng)研究觀察到PBMCs中IFN-I評(píng)分與血漿IL-10水平之間存在中度正相關(guān)，這可能支持在COVID-19患者中觀察到的IFN-I反應(yīng)強(qiáng)度與IL-10抑制反應(yīng)之間的相關(guān)性。此外，該項(xiàng)研究觀察到與穩(wěn)定期患者者相比，進(jìn)展期受試者的抗原提呈細(xì)胞(APCs)中MHC-II轉(zhuǎn)錄本降低，后者更類似于對(duì)照受試者。眾所周知，IL-10的增加會(huì)下調(diào)MHC-II、這可能解釋了進(jìn)展期受患者的下降?？傊?，在進(jìn)展期患者中，IL-10增加和MHC-II減少的抑制信號(hào)可能是一把雙刃劍:一方面，減少炎癥和保護(hù)組織免受免疫相關(guān)損傷，另一方面，阻礙有效抗病毒反應(yīng)的能力。
為了更好地理解穩(wěn)定型和進(jìn)展期COVID-19單核細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄差異，該項(xiàng)研究在排除對(duì)照組細(xì)胞后對(duì)其進(jìn)行亞聚類。在7個(gè)簇中產(chǎn)生23,701個(gè)單核細(xì)胞。該項(xiàng)研究在穩(wěn)定和進(jìn)展期的病人細(xì)胞中確定了一個(gè)清晰的分界, 這部分是由進(jìn)展期患者中ISGs的表達(dá)增加所驅(qū)動(dòng)的, 調(diào)節(jié)和組織修復(fù)相關(guān)基因在進(jìn)展期單核細(xì)胞與穩(wěn)定期單核細(xì)胞中增加，包括CD163、IL1R2、AREG、共抑制受體HAVCR2(編碼TIM-3)及其配體LGALS9(編碼Galectin-9)和IL10。在進(jìn)展期患者中，編碼具有抗病毒活性(主要針對(duì)單鏈RNA病毒)的RNASE2蛋白的表達(dá)也增加了。值得注意的是,LGALS9表達(dá)增加不僅在髓細(xì)胞還在B細(xì)胞和進(jìn)展期患者的CD4+T細(xì)胞, 這表明TIM-3/Gal-9通路在髓系細(xì)胞/T細(xì)胞相互作用中具有潛在的作用，可以增強(qiáng)進(jìn)展期患者髓系細(xì)胞的調(diào)節(jié)表型，如在癌癥患者中觀察到的。
如圖所示，進(jìn)展期單核細(xì)胞中MHC-II分子減少。警報(bào)素S100A8/S100A9在進(jìn)展期單核細(xì)胞與穩(wěn)定期單核細(xì)胞中的DEGs中排名最高。值得注意的是，S100A8/9的表達(dá)也受托珠單抗治療的影響。由于S100A9是骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的標(biāo)記物，并能促進(jìn)IL-10的生成和MDSCs的抑制能力，進(jìn)展期患者的單核細(xì)胞特征與MDSCs有些類似。事實(shí)上，兩個(gè)經(jīng)典單核細(xì)胞簇中的一個(gè)富含MHC-II低表達(dá)的MDSCs相關(guān)基因(S100A8,S100A9,IL1R2, IL10)。此外，該單核細(xì)胞簇顯示出與最近發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重?cái)⊙Y單核細(xì)胞群高度重疊的轉(zhuǎn)錄特征。出乎意料的是，與對(duì)照組相比，在進(jìn)展期和穩(wěn)定期患者中，促炎單核細(xì)胞標(biāo)志物IL1B和TNF在COVID-19單核細(xì)胞中均下調(diào)，盡管在穩(wěn)定期患者中IL1B的下調(diào)略低。這一觀察結(jié)果與最近報(bào)道的COVID-19嚴(yán)重呼吸衰竭患者的免疫抑制表型一致
綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)揭示了進(jìn)展期患者單核細(xì)胞的扭曲調(diào)控特征，類似于免疫癱瘓。鑒于這些與免疫抑制表型相關(guān)的基因中有許多是受IFN-I信號(hào)下游調(diào)控的(AREG, IL1R2, S100A8,S100A9,IL10)，這種經(jīng)典單核細(xì)胞向MDSC樣抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)變可能源于強(qiáng)烈的IFN-I反應(yīng)。此外，該項(xiàng)研究的連接體分析強(qiáng)調(diào)了增強(qiáng)的TIM-3/Gal-9環(huán)路，這可能有助于異常的調(diào)控髓系特征。這種過(guò)早地轉(zhuǎn)向緩解期可能會(huì)中斷適當(dāng)?shù)目共《久庖叻磻?yīng)，導(dǎo)致病毒清除延遲和在嚴(yán)重COVID-19中觀察到的有害臨床表現(xiàn)。
接下來(lái)，該項(xiàng)研究嘗試檢測(cè)不同疾病條件下CD8+ T細(xì)胞亞群的基因表達(dá)差異。詳細(xì)分析子集19458個(gè)CD8+ T細(xì)胞顯示在穩(wěn)定型和進(jìn)展期患者之間有明顯的區(qū)分, 這主要是由于進(jìn)展期患者中ISGs 的高表達(dá), 也可以通過(guò)效應(yīng)細(xì)胞因子如GZMB的高表達(dá)來(lái)顯示。大多數(shù)來(lái)自IFN激活的CD8+ T細(xì)胞簇的細(xì)胞位于進(jìn)展期部分，并與效應(yīng)T細(xì)胞簇重疊?；虮磉_(dá)譜從早期時(shí)間點(diǎn)A到晚期時(shí)間點(diǎn)B有明顯的變化，主要是由ISG信號(hào)的減少驅(qū)動(dòng)的。后續(xù)研究表明共抑制受體LAG3在進(jìn)展患者的T淋巴細(xì)胞中表達(dá)增加，而其配體(MHC-II分子)在抗原提呈細(xì)胞中表達(dá)減少。
10名COVID-19患者中有8名接受了抗IL-6受體(IL-6R)抗體托珠單抗治療。該項(xiàng)研究進(jìn)一步研究了與托珠單抗治療相關(guān)的差異基因表達(dá)模式。IL6R在單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞(包括FoxP3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs))和原始CD8+ T細(xì)胞中高表達(dá)。另一方面，IL6R在其他類型的淋巴細(xì)胞中表達(dá)較低，包括記憶性CD8+、效應(yīng)性CD4+和CD8+ T細(xì)胞，gamma-delta T細(xì)胞，B細(xì)胞和NK細(xì)胞。IL6ST(編碼gp130)負(fù)責(zé)IL-6與IL-6R結(jié)合后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在所有類型的PBMCs中都有表達(dá)。為了確定托珠單抗治療對(duì)COVID-19患者的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，該項(xiàng)研究比較了托珠單抗治療組與未接受托珠單抗治療組患者從A到B時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)變化。該項(xiàng)研究重點(diǎn)研究了6個(gè)與IL-6通路相關(guān)的托珠單抗應(yīng)答基因(ARID5A, BCL3, PIM1, SOCS3, BATF, MYC)，已知它們?cè)陬愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中會(huì)被托珠單抗干擾。值得注意的是，托珠單抗的這些轉(zhuǎn)錄變化主要在高表達(dá)IL6R和IL6ST的細(xì)胞類型中觀察到，如初始CD4+ T細(xì)胞、記憶CD4+ T細(xì)胞、初始CD8+ T細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞。為了量化這一效應(yīng)，該項(xiàng)研究進(jìn)行了IL-6評(píng)分(上述6種托珠單抗應(yīng)答基因的綜合評(píng)分)。該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，所有接受托珠單抗治療的患者CD4+ T細(xì)胞中IL-6評(píng)分顯著下降，而未接受托珠單抗治療的患者沒(méi)有下降。
接下來(lái)，該項(xiàng)研究試圖識(shí)別在COVID-19患者中被托珠單抗干擾的其他基因。為了盡可能減少疾病相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間變化的混雜效應(yīng)，該項(xiàng)研究重點(diǎn)研究了非托珠單抗組中基因表達(dá)沒(méi)有隨時(shí)間變化而下降，但在托珠單抗治療后顯著下降的基因。該項(xiàng)研究證明，在大多數(shù)細(xì)胞類型中，托珠單抗治療后S100A8和S100A9的表達(dá)高度下調(diào)，但在非托珠單抗組中未發(fā)生變化，甚至略有升高。鑒于S100A8/9和IL-6之間存在一個(gè)正向前饋回路，可以驅(qū)動(dòng)促炎癥通路，血清S100A8/9升高是COVID-19重癥患者的標(biāo)志之一，托珠單抗可能通過(guò)抑制COVID-19中S100A8/9的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。有趣的是，IL6R在髓系細(xì)胞中的表達(dá)高于IL6ST，而在其他所有細(xì)胞類型中的表達(dá)都低，導(dǎo)致IL6R/IL6ST比值的差異。根據(jù)最近的一項(xiàng)研究，這個(gè)比例決定了對(duì)IL-6信號(hào)的反應(yīng)類型，在具有高IL6R/IL6ST的細(xì)胞中抗炎經(jīng)典信號(hào)(在該項(xiàng)研究的髓細(xì)胞中觀察到)或在低IL6R/IL6ST的細(xì)胞中促炎反式信號(hào)(非髓系細(xì)胞)，可能解釋了觀察到的細(xì)胞類型對(duì)托珠單抗反應(yīng)的差異。雖然該項(xiàng)研究在細(xì)胞水平上檢測(cè)到對(duì)托珠單抗的反應(yīng)，但該項(xiàng)研究的研究既不是設(shè)計(jì)的，也不是為了檢測(cè)治療的任何臨床效果。盡管如此，這些基因表達(dá)模式可能表明COVID-19患者中托珠單抗效應(yīng)、IL6R、IL6ST和S100A8/9之間存在關(guān)聯(lián)。
接下來(lái)，該項(xiàng)研究使用CITE-seq構(gòu)建了一個(gè)獨(dú)立的PBMCs免疫表型圖譜。為了更好地識(shí)別細(xì)胞多聯(lián)體，使該項(xiàng)研究能夠?qū)⒓?xì)胞超負(fù)載到10X平臺(tái)上，該項(xiàng)研究使用細(xì)胞哈希技術(shù)，在每個(gè)10X反應(yīng)中復(fù)用5-6個(gè)樣品。該項(xiàng)研究采用189個(gè)寡核苷酸標(biāo)記的抗體。從下游分析中去除樣本來(lái)源不明的多片段和細(xì)胞，83.2%的細(xì)胞進(jìn)行分析(n=43,349)在無(wú)監(jiān)督聚類之后，通過(guò)使用手工管理的標(biāo)記基因列表，對(duì)CITE-seq細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)和抗體來(lái)源計(jì)數(shù)(ADT)注釋。該項(xiàng)研究觀察到一組未確定的細(xì)胞(n= 8032)，它們的ADT信號(hào)的多個(gè)譜系標(biāo)記呈陽(yáng)性，并且/或顯示出不太可能用免疫學(xué)證據(jù)解釋的信號(hào)升高 。這些細(xì)胞從分析中移除，所有其他細(xì)胞繪制在UMAP空間上。為了研究?jī)煞N注釋的一致性，該項(xiàng)研究計(jì)算了RNA注釋和ADT注釋的細(xì)胞類型之間共享細(xì)胞的百分比。
重疊的細(xì)胞類型中,該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)49%的ADT注釋激活效應(yīng)T細(xì)胞集群(HLA-DR+CD38+)與GEX重疊劃分T/NK集群, HLADRA / CD38和MKI67標(biāo)志著獨(dú)特的T細(xì)胞在COVID-19亞群。HLA-DR和CD38的雙重表達(dá)或Ki67的高表達(dá)被認(rèn)為是急性病毒感染中高度活化的T細(xì)胞群的標(biāo)志。該項(xiàng)研究觀察到在COVID-19患者中，GEX分裂T/NK集群中表達(dá)MKI67的TCR+ T細(xì)胞增加，這一結(jié)果通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在相同樣本和不同隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證，特別是在進(jìn)展期患者的CD4+ T細(xì)胞中.最近一項(xiàng)對(duì)大量COVID-19患者使用流式細(xì)胞術(shù)的研究支持了這一觀察結(jié)果。
CITE-seq技術(shù)進(jìn)一步使該項(xiàng)研究能夠闡明這些活化的T細(xì)胞群的轉(zhuǎn)錄特征。與其他T細(xì)胞簇相比，HLA-DR+CD38+ T表達(dá)共抑制受體(LAG3、CTLA4、PDCD1、ENTPD1、HAVCR2)，初始/干細(xì)胞標(biāo)志物(TCF7、LEF1)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞標(biāo)志物(NKG7、KLRG1、PRF1、GZMH)表達(dá)較低。促進(jìn)T細(xì)胞衰竭的轉(zhuǎn)錄因子(TFs) (PRDM1, MAF)也在該集群中富集。這些數(shù)據(jù)表明，在這一簇的T細(xì)胞顯示扭曲的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志向終末分化。
接下來(lái)，該項(xiàng)研究確定了這種活化的T細(xì)胞簇在穩(wěn)定期和進(jìn)展期COVID-19患者之間是否存在轉(zhuǎn)錄差異。進(jìn)展期患者IFN-I應(yīng)答基因(MX1, IRF7, ISG20)和細(xì)胞毒性/促炎細(xì)胞因子(PRF1, GZMH, IFNG)表達(dá)較高，干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)志物(TCF7, LEF1)表達(dá)較低。有趣的是，大多數(shù)共抑制受體在進(jìn)展期患者(LAG3, CTLA4, HAVCR2)中富集，一些在穩(wěn)定期患者中富集(PDCD1, TIGIT)。衰竭/效應(yīng)驅(qū)動(dòng)TFs (PRDM1, MAF)和在衰竭T細(xì)胞中表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL10在進(jìn)展性患者中上調(diào)。該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展期COVID-19患者激活的T細(xì)胞中，LAG-3是上調(diào)最多的共抑制受體，這一結(jié)果通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同隊(duì)列的COVID-19患者進(jìn)行了驗(yàn)證。考慮到共同抑制受體的高表達(dá)標(biāo)志著T細(xì)胞耗竭和最近的研究表明在COVID-19的T細(xì)胞中觀察到類似衰竭的基因表達(dá)模式，該項(xiàng)研究試圖通過(guò)基因集富集分析(GSEA)來(lái)確定這些分裂的T細(xì)胞在進(jìn)展患者中的基因表達(dá)特征。與穩(wěn)定期患者相比，進(jìn)展期患者的T細(xì)胞分裂表現(xiàn)出更多的終末耗竭T細(xì)胞信號(hào)和IFN-I反應(yīng)信號(hào)。進(jìn)展期COVID-19患者的轉(zhuǎn)錄特征與進(jìn)展期與對(duì)照的HIV特異性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征重疊。盡管在病毒感染的急性階段觀察T細(xì)胞衰竭還為時(shí)過(guò)早，但考慮到IFN-I通路在腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞和慢性病毒感染中都促進(jìn)了T細(xì)胞衰竭，該項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明，進(jìn)展期COVID-19患者更強(qiáng)或更長(zhǎng)時(shí)間的IFN-I反應(yīng)可能會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞提前分化。
據(jù)這些觀察，該項(xiàng)研究進(jìn)一步試圖了解穩(wěn)定和進(jìn)展患者之間免疫細(xì)胞相互作用的變化。在LAG-3配體中，該項(xiàng)研究觀察到進(jìn)展期COVID-19患者骨髓細(xì)胞和B細(xì)胞上的MHC-II分子顯著減少，這也在該項(xiàng)研究對(duì)進(jìn)展期與穩(wěn)定期COVID-19患者的差異分析中得到了證實(shí)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示CD4+ T細(xì)胞上的LAG-3與CD14+ 經(jīng)典單核細(xì)胞上的HLA-DR呈負(fù)相關(guān)，提示LAG-3/MHC-II相互作用的改變可能在疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。
總之，該項(xiàng)研究的scRNA-seq分析和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證顯示在COVID-19患者中，激活的T細(xì)胞數(shù)量增加，LAG-3的表達(dá)更高。此外，對(duì)這一人群的轉(zhuǎn)錄分析顯示，在進(jìn)展期COVID-19患者中共抑制受體表達(dá)較高，并且出現(xiàn)了一個(gè)終分化的T細(xì)胞樣特征。T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞之間不平衡的LAG-3/MHC-II相互作用可能反映了固有適應(yīng)性細(xì)胞相互作用的失敗，導(dǎo)致細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的異常表達(dá)，進(jìn)而可能導(dǎo)致免疫病理的變化。
為了鑒定與SARS-CoV-2免疫相關(guān)的T細(xì)胞受體(TCR)，該項(xiàng)研究對(duì)COVID-19和對(duì)照樣本進(jìn)行了單細(xì)胞V(D)J分析。總共捕獲67393個(gè)細(xì)胞的TCR數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本的中位數(shù)為1954個(gè)細(xì)胞。數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和控制過(guò)濾出8303個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣本中位數(shù)為1778個(gè)細(xì)胞?；谶@些高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，來(lái)自同一受試者的具有相同的β和α鏈V(D)J序列的細(xì)胞被分組為克隆?？偣灿?1,742個(gè)唯一克隆被鑒定，平均每個(gè)樣本有1297個(gè)克隆。
使用Alakazam R包計(jì)算記憶CD4+ T細(xì)胞和初始CD4+ T細(xì)胞以及記憶和初始CD8+ T細(xì)胞的Alpha多樣性和稀疏性。進(jìn)展期患者的記憶和初始CD8+ T細(xì)胞在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的多樣性均低于穩(wěn)定期患者，這與進(jìn)展期患者CD8+ T細(xì)胞克隆擴(kuò)增較高是一致的。這種alpha多樣性的差異在記憶和初始CD4+ T細(xì)胞中沒(méi)有觀察到。進(jìn)展期和穩(wěn)定期患者在A、B時(shí)間點(diǎn)CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞克隆豐富度和均勻度的變化無(wú)明顯差異，可能是進(jìn)展期患者在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有數(shù)據(jù)的數(shù)量較少所致。
為了識(shí)別可能賦予SARS-CoV-2特異性的TCR區(qū)域特征，該項(xiàng)研究使用GLIPH2評(píng)估COVID-19患者的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)序列的相似性。該項(xiàng)研究專門在β鏈中尋找CDR3基序，這些基序在幾個(gè)COVID-19患者中共享，但在13名對(duì)照組中沒(méi)有。嚴(yán)格的過(guò)濾器應(yīng)用于GLIPH2 CDR3特異性組(或簇)以提高準(zhǔn)確性，特異性組有大于3個(gè)獨(dú)特的TCR，顯著的 V-gene 偏倚(p<0.05)。篩選的特異性組與對(duì)照樣本的任何克隆都被過(guò)濾掉，以增強(qiáng)對(duì)SARS-CoV-2的特異性，而不是對(duì)巨細(xì)胞病毒等其他常見(jiàn)病毒的特異性。經(jīng)重度過(guò)濾后，CD8+ 和CD4+ T細(xì)胞分別為24組和172組。大多數(shù)鑒定的特異性組包括來(lái)自不同樣品的克隆，表明潛在的SARS-CoV-2特異性克隆的CDR3序列有很大的相似性。為了進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)克隆擴(kuò)增的SARS-CoV-2應(yīng)答T細(xì)胞的特異性，該項(xiàng)研究重點(diǎn)研究了來(lái)自3名受試者的10個(gè)CD8+ 和12個(gè)CD4+ T細(xì)胞組，其中至少有一個(gè)克隆含有2個(gè)細(xì)胞。使用V和J基因分析顯示強(qiáng)大的J基因偏誤在3個(gè)CD8+ 組和1個(gè)CD4+ 組。一些VJ組合顯示主要使用如TRAV5/TRAJ12 /TRBJ2-7/TRBV5-6對(duì)簇1的使用占主導(dǎo)地位。CD4+ T組V基因使用無(wú)明顯偏倚，J基因使用以TRBJ2-5為主
在10個(gè)和12個(gè)假定的SARS-CoV-2特異性和擴(kuò)展組中，該項(xiàng)研究進(jìn)一步選擇了來(lái)自大于等于3個(gè)不同COVID-19患者的克隆，其中大于等于55%的克隆具有一個(gè)以上的細(xì)胞，從而分別形成5組和2組CD8+ 和CD4+ T細(xì)胞。選擇的集群也是前5和前2克隆集群，GLIPH2的組成分?jǐn)?shù)最好，它衡量了基于全球/局部相似性的特異性組的強(qiáng)度，常見(jiàn)V基因的富集，有限的CDR3長(zhǎng)度分布，擴(kuò)展克隆(ECs)和集群大小。這表明所選擇的特異性組可能來(lái)自SARS-CoV-2特異性ECs，并在COVID-19患者中共享，具有高度保守的CDR3氨基酸(AA)序列。所有特異性組都是基于CDR3區(qū)域的全局相似性來(lái)確定的，除了CD8+ T細(xì)胞中的cluster IV，其成員克隆具有不同的CDR3長(zhǎng)度，但具有相同的模體QDIG。具有全局相似性的特異性組的CDR3序列基序。該項(xiàng)研究證實(shí)了該項(xiàng)研究的樣本不受HLA基因型的影響。CDR3基序與最近兩項(xiàng)采用TCR表數(shù)據(jù)的SARS-CoV-2研究中發(fā)現(xiàn)的CDR3基序進(jìn)行了比較，這些研究主要收集的樣本來(lái)自于SARS-CoV-2的恢復(fù)期和恢復(fù)期患者。結(jié)果顯示，該項(xiàng)研究的CD8+ 特異性組V motif (TNTGE)與Schulthei?等發(fā)現(xiàn)的TGTGE motif (TGTGE)具有相似的模式。該研究沒(méi)有在SARS-CoV-2康復(fù)患者共享的前31個(gè)模體中發(fā)現(xiàn)該模體，但發(fā)現(xiàn)在疾病活動(dòng)性期間以及從一名輕度疾病患者和康復(fù)患者的恢復(fù)過(guò)程中，該模體在縱向樣本中共享，這表明該模體對(duì)SARS-CoV-2具有特異性。這種重疊驗(yàn)證了該項(xiàng)研究的CD8+ 組 V模體對(duì)SARS-CoV-2感染的特異性。在活躍性疾病期間的樣本采集和排除對(duì)照樣本中存在的特異性組的GLIPH2分析也證明了該項(xiàng)研究的TCR分析的重要性。
每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)、每種B細(xì)胞類型(初始B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞)的頻率、每種同型(IGHM/D/G/A)的頻率分別匯總?？偟膩?lái)說(shuō)單細(xì)胞V(D)J文庫(kù)包含7177個(gè)細(xì)胞，分布在18個(gè)樣品中。
COVID-19患者的IGHV/IGHJ突變頻率和CDR-H3長(zhǎng)度因抗體類型和細(xì)胞類型不同而不同。IGHM記憶細(xì)胞和血漿B細(xì)胞的突變頻率顯著低于5%，無(wú)論治療或疾病進(jìn)展組。正如所料，IGHG記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞的突變頻率高于IGHM細(xì)胞。特別是穩(wěn)定且未接受治療的COVID-19患者漿細(xì)胞突變頻率明顯高于5%。穩(wěn)定患者在托珠單抗治療下的記憶細(xì)胞有更高的突變頻率。
IGHG和IGHM的B細(xì)胞的CDR-H3長(zhǎng)度一般在10到20 AAs之間變化(該項(xiàng)研究使用15 AAs作為下游比較)。然而,IGHG漿細(xì)胞的CDR-H3長(zhǎng)度在COVID-19穩(wěn)定患者中明顯大于15AAs;而IGHG記憶細(xì)胞的CDR-H3長(zhǎng)度與15個(gè)AAs沒(méi)有顯著差異。平均而言，穩(wěn)定的非托珠單抗患者的IGHG漿細(xì)胞CDR-H3長(zhǎng)度大于穩(wěn)定的托珠單抗治療患者。
該項(xiàng)研究試圖調(diào)查兩個(gè)抽血時(shí)間點(diǎn)(A和B) CDR-H3 AA使用的差異。該項(xiàng)研究通過(guò)計(jì)算CDR-H3段中每個(gè)AA在時(shí)間點(diǎn)B相對(duì)于時(shí)間點(diǎn)A的條件信息內(nèi)容(IC)來(lái)處理這個(gè)問(wèn)題。該項(xiàng)研究平均了三個(gè)不同組患者的ICs條件:(1)未接受治療的穩(wěn)定患者;(2)托珠單抗治療的進(jìn)展型患者(托珠單抗-進(jìn)展型);(3)托珠單抗治療下病情穩(wěn)定的患者(托珠單抗-穩(wěn)定型)。研究的結(jié)果表明，AA在托珠單抗-穩(wěn)定型患者中的使用情況與其他組相當(dāng)不同。事實(shí)上，托珠單抗-穩(wěn)定型患者的IGH指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)之間對(duì)CDR-H3段特異性AAs使用的偏好沒(méi)有任何變化。相反，進(jìn)展期和非穩(wěn)定期患者的IC分布在不同的AAs中是不同的。特別是，相對(duì)于A，進(jìn)展期和不穩(wěn)定期的患者在B時(shí)點(diǎn)丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)和酪氨酸(Y)的使用量增加，脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)和蘇氨酸(T)的使用量減少。
為了探究COVID-19患者的抗原驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞應(yīng)答，該項(xiàng)研究研究了擴(kuò)展克隆譜系。該項(xiàng)研究鑒定了20個(gè)擴(kuò)展克隆(ECs)，采用了來(lái)自15/18的樣本，包含1157/7177個(gè)細(xì)胞(占所有B細(xì)胞的16%)。在ECs中漿細(xì)胞顯著富集。TP7A和TP7B樣品不含漿細(xì)胞。在托珠單抗-穩(wěn)定型患者的ECs中，在托珠單抗-穩(wěn)定型的ECs中，IGHG細(xì)胞顯著富集，在托珠單抗-進(jìn)展型的ECs中，IGHM細(xì)胞顯著富集
該項(xiàng)研究進(jìn)一步研究了ECs內(nèi)細(xì)胞的突變頻率和CDR-H3長(zhǎng)度。該項(xiàng)研究觀察到，無(wú)論治療狀態(tài)如何，穩(wěn)定患者的IGHG漿細(xì)胞的突變頻率平均高于進(jìn)展患者。穩(wěn)定患者IGHG漿細(xì)胞的CDR-H3長(zhǎng)度明顯大于15個(gè)AAs。特別是，未接受治療的患者比接受治療的患者有更大的平均CDR-H3長(zhǎng)度。進(jìn)展期患者IGHG漿細(xì)胞的CDR-H3長(zhǎng)度明顯短于15個(gè)AAs。
在其他抗病毒反應(yīng)中已觀察到針對(duì)特定抗原選擇特定IGHV基因，例如針對(duì)某些流感病毒抗原選擇IGHV1-69基因。因此，該項(xiàng)研究試圖在COVID-19患者中篩選IGHV基因。IGHV4-34基因在穩(wěn)定患者的ECs中使用較多，治療組的優(yōu)勢(shì)比為~10，未治療組的優(yōu)勢(shì)比為~9.5。進(jìn)展期患者使用IGHV4-34較低，優(yōu)勢(shì)比為~5.9。該項(xiàng)研究進(jìn)一步對(duì)擴(kuò)展的B細(xì)胞克隆進(jìn)行了IGHV基因使用的主成分分析(PCA)。該項(xiàng)研究已經(jīng)確定了一組正在治療的患者，包括穩(wěn)定和進(jìn)展的患者，其對(duì)應(yīng)的ECs只包含IGHV1-46(100%在TS4B)， IGHV3-21(100%在TS2B)， IGHV3-30-3(85%在TS3A)和IGHV3-72(100%在TP6A)。
BCR序列分析可以為研究COVID-19內(nèi)B細(xì)胞的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提供重要信息。先前的工作證明與健康對(duì)照組相比，COVID-19患者中未突變的IGHG B細(xì)胞克隆比例更高。這可能是初級(jí)免疫反應(yīng)中GC進(jìn)入前早期類切換的跡象。該項(xiàng)研究同樣觀察到，考慮到擴(kuò)增克隆和未擴(kuò)增克隆，每個(gè)患者中有0% - 45.7%的IGHG克隆未突變。此外，與進(jìn)展期患者相比，穩(wěn)定期患者未突變的IGHG克隆比例更高，盡管這種差異不顯著。最近的一項(xiàng)分析表明，這種未突變的胞漿細(xì)胞的擴(kuò)增是住院的COVID-19患者的特征，而不是有輕微癥狀的患者。這些克隆主要由記憶細(xì)胞和漿細(xì)胞組成，而IGHM克隆主要由IGHM細(xì)胞組成。該項(xiàng)研究還觀察到多個(gè)不同的B細(xì)胞克隆，包括擴(kuò)展的和非擴(kuò)展的，跨越兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。為了描述這些克隆的潛在親和性，該項(xiàng)研究為所有克隆建立了至少包含三個(gè)序列的B細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)育樹，這些序列要么是不同的，要么是在不同的時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的。該項(xiàng)研究在時(shí)間點(diǎn)A觀察到這些克隆中SHM水平相對(duì)較高。然后，該項(xiàng)研究使用系統(tǒng)發(fā)育的根尖相關(guān)檢驗(yàn)來(lái)確定這20個(gè)克隆從種系序列的差異是否在A和B時(shí)間點(diǎn)之間增加。樣本時(shí)間與序列共同祖先的差異無(wú)顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明，在這些克隆中缺乏可測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)SHM積累。綜上所述，觀察到的未突變的漿細(xì)胞的擴(kuò)張和可測(cè)量的B細(xì)胞進(jìn)化的缺乏與之前的研究一致，可作為COVID-19住院患者中生發(fā)中心反應(yīng)中斷的證據(jù)。
該項(xiàng)研究在8名患者中發(fā)現(xiàn)了19個(gè)聚集性抗體簇。79%(15/19)的聚集性簇包括來(lái)自托珠單抗-穩(wěn)定型患者的抗體，47%(9/19)包括來(lái)自非托珠單抗穩(wěn)定患者的抗體，31%(6/19)的聚集性簇包括來(lái)自托珠單抗-進(jìn)展型患者的抗體。接下來(lái)，該項(xiàng)研究將重點(diǎn)放在托珠單抗-穩(wěn)定型的患者身上，這些患者在最集中的群體中有代表性。該項(xiàng)研究確定了6個(gè)聚集性簇，僅由托珠單抗-穩(wěn)定型患者組成。這些抗體聚集在兩名患者之間，由IGHV1-46/IGHJ3、IGHV3-23/IGHJ6、IGHV3-33/IGHJ6、IGHV3-48/IGHJ3、IGHV4-59/IGHJ6、IGHV5-51/IGHJ4基因組成。
總之，該項(xiàng)研究的多組學(xué)單細(xì)胞分析顯示，在托珠單抗治療下，COVID-19表現(xiàn)穩(wěn)定和進(jìn)展的患者發(fā)生了動(dòng)態(tài)免疫反應(yīng)。該項(xiàng)研究全面的免疫分析強(qiáng)調(diào)了COVID-19中巨大的IFN-I反應(yīng)以及非同步的適應(yīng)性和先天免疫相互作用?；虮磉_(dá)和表面蛋白聯(lián)合分析揭示了進(jìn)展患者中活化T細(xì)胞亞群的超IFN-I反應(yīng)。在活化的T細(xì)胞中，過(guò)度的調(diào)節(jié)性固有免疫反應(yīng)和獨(dú)特的共抑制受體表達(dá)是疾病進(jìn)展的標(biāo)志。在COVID-19患者中發(fā)現(xiàn)了CD8+ T細(xì)胞的傾斜T細(xì)胞庫(kù)和獨(dú)特的富集VDJ序列。在SARS-CoV-2感染急性期，沒(méi)有獲得體細(xì)胞高突變的漿細(xì)胞擴(kuò)增與早期原發(fā)性和/或?yàn)V泡外反應(yīng)相一致。最后，該項(xiàng)研究描述了對(duì)托珠單抗的細(xì)胞反應(yīng)，包括大多數(shù)細(xì)胞類型中托珠單抗治療患者中S100A8/9的表達(dá)下降。
該項(xiàng)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使該項(xiàng)研究能夠確定:
該項(xiàng)研究的無(wú)偏系統(tǒng)生物學(xué)方法利用新的多模態(tài)單細(xì)胞分析技術(shù)揭示了這種疾病的免疫反應(yīng)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。它突出了區(qū)分穩(wěn)定型和進(jìn)展型COVID-19患者的獨(dú)特免疫特征。該研究中的免疫網(wǎng)絡(luò)特征，提高了對(duì)在嚴(yán)重疾病中促進(jìn)病理的豐富的細(xì)胞相互作用和影響的理解，包括先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的非同步化。
總的來(lái)說(shuō)，該項(xiàng)研究全面的免疫分析強(qiáng)調(diào)了在進(jìn)展期COVID-19中先天性和適應(yīng)性免疫相互作用的不同步，這可能導(dǎo)致病毒清除的延遲。對(duì)嚴(yán)重COVID-19免疫細(xì)胞圖譜的高分辨率理解將增強(qiáng)該項(xiàng)研究開發(fā)免疫調(diào)節(jié)治療方法的能力，以防止COVID-19患者病情進(jìn)一步進(jìn)展。
www.covidcellatlas.com: http://www.covidcellatlas.com
聯(lián)系客服
