編譯：稻和，編輯：景行、江舜堯。
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亨廷頓病(HD)是一種由Huntingtin(HTT)基因第1外顯子的CAG三核苷酸重復擴增引起的致命神經(jīng)退行性疾病。在HD中，突變的亨廷頓蛋白（mHTT）導致神經(jīng)元細胞死亡的機制尚未完全明確。為了探究其中新的分子機制，本文研究人員利用單核RNA測序（snRNA-seq）和翻譯核糖體親和純化（TRAP）的方法介導了人HD與鼠HD模型尾狀核/殼核(紋狀體)細胞類型特異性基因表達變化的轉錄組分析。結果表明，在HD最脆弱的紋狀體刺狀投射神經(jīng)元中，研究人員觀察到線粒體RNA (mtRNA)(一種強有力的線粒體衍生的天然免疫原)的釋放，并同時發(fā)現(xiàn)刺狀投射神經(jīng)元中固有免疫信號的上調(diào)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)釋放的mtRNA能夠直接連接固有免疫雙鏈RNA感受器蛋白激酶R(PKR)，僅對線粒體功能的化學抑制(不存在mHTT)足以誘導人神經(jīng)元PKR的表達。研究人員在本文中強調(diào)了考慮細胞類型特異性轉錄失調(diào)在HD發(fā)病機制中的重要性，并提出mHTT導致線粒體失調(diào)與引起固有抗病毒免疫信號觸發(fā)的mtRNAs釋放，進而導致HD中神經(jīng)元的脆弱性增強的模型。
論文ID
原名：Cell Type-Specifific Transcriptomics Reveals that Mutant Huntingtin Leads to Mitochondrial RNA Release and Neuronal Innate Immune Activation
譯名：細胞類型特異性轉錄組學揭示突變的亨廷頓蛋白導致線粒體RNA釋放和神經(jīng)元固有免疫激活
期刊：Neuron
IF：14.415
發(fā)表時間：2020年9月
通訊作者：Myriam Heiman
通訊作者單位：麻省理工學院腦與認知科學系
DOI號：10.1016/j.chemosphere.2020.126158
實驗設計
結果
為了獲取細胞類型特異性基因表達譜，研究人員運用了翻譯核糖體親和層析的方法探究了常用的鼠HD轉基因與系列等位基因敲入HD模型。此外，研究人員還利用無偏見的單核RNA-seq探究了鼠常用HD模型與人2-4期HD的細胞類型特異性轉錄組改變（圖1）。
圖1 高密度脂蛋白和高密度脂蛋白小鼠模型的細胞類型特異性紋狀體基因表達譜。
（常用的轉基因R6/2外顯子1 mHTT片段HD模型和等位基因系列敲除蛋白(Q20、Q50、Q111、Q170和zQ175DN) HD模型用于翻譯核糖體親和純化(TRAP)圖譜，該圖譜通過免疫親和純化遺傳確定細胞類型中的GFP標記的核糖體復合物來純化成熟的細胞質定位的mRNAs。R6/2和zQ175DN模型也用于單核RNA測序(snRNA-seq)，其基于捕獲的核序列報告基因表達變化。HD 2-4級患者和對照組尾狀核和殼核(紋狀體)組織樣本也用于snRNA-seq。）
1 HD小鼠模型細胞類型特異性基因表達分析
為了描述HD中最容易受影響的細胞類型紋狀體SPNs，以及與HD相關并提供大量興奮性谷氨酸輸入到紋狀體的皮質紋狀體投射神經(jīng)元(CStrPNs)（圖2A），研究人員在方法上選擇了能在細胞類型群體水平上提供高分辨率并檢測成熟mRNA的TRAP方法。模型上，研究人員選擇了9月齡經(jīng)典的HD模型(R6/2)鼠。研究人員先描述了差異基因在三種細胞類型發(fā)生的變化以及重疊相似程度。接著描述了差異基因在三種細報富集通路的情況(圖2B-E)。最后，研究人員利用權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA)的方式驗證了模塊基因共表達情況以及最顯著的通路變化富集情況，并利用染色質富集分析(CHeA)進行了驗證。
圖2 通過TRAP對HD的R6/2模型中紋狀體刺狀投射神經(jīng)元(SPNs)和皮質紋狀體投射神經(jīng)元(CStrPNs)進行基因表達變化的細胞類型特異性分析。A：iSPN、dSPN、CStrPNs的示意圖 BC；R6/2三種細胞差異基因的數(shù)量變化以及相應的獨特與重合的韋恩圖 D：三種細胞的SPN Marker表達情況 E：R6/2中三種細胞類型的上調(diào)與下調(diào)的KEGG差異基因富集通路。研究人員發(fā)現(xiàn)針對于dSPN和iSPN，上調(diào)的差異基因主要富集于突觸傳導功能下調(diào)，上調(diào)的差異基因主要富集于DNA錯配修復通路。CStrPN與iSPN類似，主要的區(qū)別集中在突觸傳遞與晝夜節(jié)律傳導途徑。
2 通過TRAP對HD等位基因系列敲入模型的紋狀體SPNs、星形膠質細胞和膽堿能中間神經(jīng)元細胞進行基因表達變化的細胞類型特異性分析
為了將這些在轉基因mHTT外顯子1 R6/2模型中獲得的數(shù)據(jù)擴展到HD的全長Htt模型，研究者選取了一系列具有mHTT等位基因的模型（伴隨CAG的敲入）并于疾病進展的早期時間點進行檢查。所有研究均基于6月，因為6月這個時間點基于全組織RNA測序研究的早期分子表型時間點，方法上研究者選擇的是能檢測成熟mRNA的TRAP方法。除描述iSPN與dSPN之外，還描述了星形膠質細胞與膽堿能中間神經(jīng)元，因為星形膠質細胞與HD病理過程相關，而膽堿中間能神經(jīng)元在HD中代表一群紋狀體大量分布（圖 3A）。為了鑒定SPN中CAG長度依賴性基因表達的變化，研究者對Q20、Q50、Q111、Q170和zQ175DN模型上述關注細胞類型基因表達變化進行線性回歸分析，該分析揭示了數(shù)千個基因在dSPN和iSPN中的表達與CAG重復擴展的程度相關，dSPN具有更多的基因取代與ISPN相比，CAG長度依賴性失調(diào)。（圖 3B）。接著對zQ175細胞特異性變化與已經(jīng)發(fā)表的zQ175組織變化的測序數(shù)據(jù)進行富集當比較，發(fā)現(xiàn)SPN基因在iSPN與dSPN中均發(fā)生下調(diào)（圖 3C）。zQ175與Q20在dSPN中，大約一半的基因失調(diào)也在iSPN中失調(diào)（圖 3D）。在CAG長度依賴的基因表達變化中，dSPN和iSPN之間共享更多的下調(diào)（相對于上調(diào)）基因通路及預測調(diào)控因子（圖 3E)。研究者進一步利用WGCNA與線性回歸分析表明每個SPN細胞類型存在基因表達與CAG長度相關的基因模塊。最終表明以上的細胞特異反應（OXPHOS）與細胞的非特異反應（晝夜節(jié)律與突觸功能）將導致iSPN對mHTT更敏感。
圖3 通過TRAP對HD等位基因系列敲入模型的紋狀體SPNs、星形膠質細胞和膽堿能中間神經(jīng)元細胞進行基因表達變化的細胞類型特異性分析。A：紋狀體SPNs（iSPNs與dSPNs）、星形膠質細胞和膽堿能中間神經(jīng)元細胞的示意圖；BD：在不同HD模型與Q20插入HD模型中四種細胞類型差異基因上下調(diào)變化以及四種細胞之間的重復與獨特基因韋恩圖；C：對比差異基因在zQ175細胞TRAP數(shù)據(jù)與zQ175組織測序數(shù)據(jù)差異基因的變化；E：利用KEGG途徑富集分析dSPN和iSPN中下調(diào)（左)和上調(diào)(右）基因以CAG長度依賴性變化的線性回歸分析，結果表明在每個SPN細胞類型中，其基因表達與CAG長度相關。此外，dSPN與iSPN中存在共享基因通路。
3 HD小鼠模型細胞類型特異性基因表達譜的研究
為了證實和擴展TRAP細胞類型特異性研究結果，研究人員在R6/2和zQ175DN HD模型小鼠中進行了與TRAP研究相同年齡的紋狀體細胞的snRNA-seq 。研究人員利用ACTIOnet進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)了一類表達Foxp2/Olfm3的神經(jīng)元亞群（圖 4A、4B)。由于Foxp2能雙向調(diào)節(jié)HD鼠的HD樣表型，因此研究人員猜測這一新定義的亞群可能構成了這一調(diào)節(jié)作用。研究人員接著比較了HD模型鼠與對照鼠紋狀體廣泛分布的細胞差異基因，發(fā)現(xiàn)結果與TRAP研究類似，許多紋狀體細胞類型低表達SPN標志基因，表明mHTT影響許多細胞共有的調(diào)控因子(圖 4C、4D)。不同細胞類型和不同HD模型的DEGs比較表明，iSPN和dSPN對mHTT的外顯子1片段與具有相同重復大小的全長敲入mHTT的反應非常相似（圖 4E、4F)。研究人員接著比較了zQ175細胞與zQ175組織的RNAseq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)SPN基因高度重疊但其它細胞類型的改變比較少(圖 4G）。研究人員進一步對差異基因進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)snRNA-seq與TRAP揭示了相同的通路變化(圖 4H）。針對snRNA-seq獲取的結果，研究人員使用CheA框架網(wǎng)絡分析得出Rarb、Foxp等可能的潛在調(diào)控因子。綜上所述，研究人員的snRNA-seq數(shù)據(jù)證實了TRAP在小鼠模型中對dSPN和iSPN的發(fā)現(xiàn)，同時還確定了這兩個小鼠模型之間的其他細胞類型之間存在不同的基因擾動。
圖4 通過snRNA-Seq對HD的R6/2和zQ175DN模型中的紋狀體細胞類型進行基因表達變化的細胞類型特異性分析。AB:15只小鼠HD模型注釋細胞類型的二維Actionset圖，7只R6/2模型小鼠和8個等基因對照，均為9周齡；CD：R6/2模型與對照(C)或zQ175DN與對照(D)相比，紋狀體細胞類型差異基因變化最顯著的上下調(diào)蛋白質編碼基因；EF：SnRNA-seq識別細胞類型基因特異性(E)下調(diào)和(F)上調(diào)在小鼠模型中重疊的意義；G：鑒定zQ175DN細胞snRNA-seq和引用已發(fā)表的zQ175DN組織RNA-seq的下調(diào)和上調(diào)基因之間重疊的意義；HI：在R6/2(H)和zQ175DN(I)模型中，dSPN和iSPN中下調(diào)和上調(diào)基因的KEGG通路分析。
4 用HD的snRNA-Seq進行細胞類型特異性基因表達分析
為了將這些HD模型研究擴展到人HD尾狀細胞和殼核細胞（紋狀體)，研究人員進一步對2-4級人HD的尾狀細胞和殼核細胞進行了snRNA-seq研究，并與對照組尾狀細胞和殼核細胞進行了比對。對表達基因的聚類分析結果表明人HD存在鼠HD模型常見的細胞類型，人尾狀和殼核樣品中存在更為罕見的細胞類型(圖 5A）。人HD尾端和殼核與對照組SPN相比，dSPNs和iSPNs呈現(xiàn)不太明顯的SPN亞型。隨著人HD分級的上升，dSPN數(shù)量增加，iSPN數(shù)量減少，與已發(fā)表的人HD增強iSPN脆弱性的研究相符（圖 5B）。接著，研究人員比較了HD組與對照組尾狀核和殼核所有足夠豐富的細胞類型的基因表達，揭示了神經(jīng)元和膠質細胞以及內(nèi)皮細胞與壁細胞的DEGS，星形膠質細胞標記基因在星形膠質細胞中的差異表達存在于人HD的不同等級，而不存在于小鼠HD模型（圖 5C-5E）。差異基因的數(shù)據(jù)分析還揭示了人HD的iSPN與dSPN存在mtRAN廣泛上調(diào)，而在鼠的HD模型中，mtRNA的上調(diào)與鼠的CAG長度依賴性相關(圖 5F）。最后，研究人員對人HD的差異基因進行了KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)iSPN與dSPN中的許多差異表達基因與突觸功能相關（圖 5G）。利用ChEA轉錄調(diào)節(jié)因子的分析表明，Kdm5b、Crem、Foxo3和Vdr是潛在的主調(diào)節(jié)因子之一，這種結果在TRPA中被驗證（圖 5H）。
圖5 通過snRNA-Seq對對照組和人HD死后組組織中尾狀核和殼核細胞類型進行基因表達變化的細胞類型特異性分析。A：對照和HD樣本中收集細胞類型的二維Actionet；圖 B：相對于對照樣本，不同等級HD的dSPN與iSPN的占比；C：人HD紋狀體細胞最顯著差異的5個上下調(diào)基因；D：鑒定紋狀體細胞的snRNA-seq和引用已發(fā)表的紋狀體組織RNA-seq的下調(diào)和上調(diào)基因之間重疊的意義；E：反應性星形膠質細胞標記基因在星形膠質細胞中的差異表達存在于人HD的不同等級，而非小鼠HD模型；F：通過snRNA-seq檢測到人HD主要紋狀體細胞類型的mtRNA上調(diào)，通過TRAP發(fā)現(xiàn)R6/2和zQ175DN小鼠模型mtRNA的上調(diào)；G：人HD上下調(diào)iSPN與dSPN差異基因的KEGG富集分析；H：通過CHEA分析預測在dSPN和iSPN中下調(diào)和上調(diào)的基因轉錄調(diào)節(jié)因子。
5 SPN中mtRNA的釋放伴隨著線粒體功能障礙
在HD snRNA-seq數(shù)據(jù)以及小鼠模型HD TRAP數(shù)據(jù)中，mtRNAs是最上調(diào)的基因之一，表明存在mtRNA釋放現(xiàn)象。為了評估m(xù)tRNA的釋放是否發(fā)生在更早的疾病模型時間點，而不是潛在的僅僅是后來的繼發(fā)性現(xiàn)象，研究人員描述了在等位基因HD系列模型中3月齡的iSPN，結果表明即使是在3月齡也存在mtRNA的釋放。為了探究mtRNA釋放的原因，研究人員比對了R6/2與zQ175的TRAP數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)iSPN中OXPHOS通路的一些主成分基因發(fā)生顯著變化（圖 6A）。此外，研究人員還證實了這種基因表達的減少導致OXPHOS功能活性從年齡匹配的小鼠模型的組織減少（圖 6B）。為了考慮其他線粒體相關的途徑，可能是mtRNA釋放的無偏方式，研究人員進一步進行了WGCNA分析的3個月和6個月的細胞類型特異性等位基因系列TRAP iSPN數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)的CAG長度依賴的方式與模型年齡相關。基于這些發(fā)現(xiàn)，研究人員進一步研究了人類snRNA-seq數(shù)據(jù)中OXPHOS mrna的表達，也觀察到許多OXPHOS mrna的下調(diào)（圖 6C）。這種與模型年齡的關聯(lián)（從早期的3個月的疾病模型時間點開始）進一步表明mtRNA釋放和減少OXPHOS基因表達之間的機制聯(lián)系。
圖6 線粒體氧化磷酸化途徑mRNA在R6/2和zQ75DN模型以及HD組織的SPN中被下調(diào)。A：OXPHOS組分復合物的示意圖以及OXPHOS組分mRNAs在9周齡或6月齡zQ175DN的dSPNs或iSPNs中的變化熱圖(與Q20對照相比)；B：9周齡時，整個R6/2組織中測量OXPHOS復合物I的活性（頂部：紋狀體；底部：海馬對照）；C：人HD組織的dSPN或iSPN中OXPHOS組分mRNAs表達改變熱圖
6 mHTT激活PKR介導的先天免疫途徑
由于細胞質中的mtRNAs已被證明是細胞質固有免疫傳感器的高度免疫原性觸發(fā)器，能夠激活人細胞中的I型干擾素反應，因此研究人員檢測了固有免疫信號通路在iSPN中是否上調(diào)。許多干擾素應答基因在iSPN中被選擇性上調(diào)，iSPN的mtRNA釋放最高(圖 7A、7B）。由于PKR最近被證明是內(nèi)源性釋放胞漿mtRNAs的傳感器，研究人員進一步證實了HD模型紋狀體組織中PKR的表達與激活。在R6/2和ZQ175DN基因敲入小鼠中，紋狀體組織中PKR不僅蛋白表達水平上調(diào)并且磷酸化增加（圖 7C、7D）。通過免疫熒光染色，研究人員發(fā)現(xiàn)在對照組織中，PKR的基本表達僅在非神經(jīng)元細胞中被觀察到(如之前報道的推測為膠質細胞)，但在HD模型中，PKR也可以在神經(jīng)元細胞中被檢測到（圖 7E）。研究人員進一步利用PKR純化的方法，發(fā)現(xiàn)在mHTT存在的情況下mtRNAs與PKR結合（圖 7F）。為了進一步評估線粒體OXPHOS活性本身的抑制是否也會導致PKR的表達，研究人員探究了在沒有mHTT的情況下，線粒體復合物I、復合物II和復合物Ⅲ的抑制對于正常(非HD)神經(jīng)元的影響。與對照處理組相比，復合物I、II和III抑制誘導PKR的表達，在無糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)可加重復合物I和II抑制的作用（圖 7G)。這些數(shù)據(jù)總體表明，直接化學抑制人神經(jīng)元線粒體OXPHOS的活性也可誘導PKR表達，類似于TRAP所揭示的mHTT對OXPHOS表達的遺傳效應（圖 7H）。
圖7. PKR介導的先天免疫途徑被mHTT激活。A：自身TRAP數(shù)據(jù)中，與固有免疫信號相關的已知干擾素刺激基因與抗病毒信號因子的表達熱圖；B：ELISA檢測紋狀體組織干擾素表達：R6/2模型9周齡（左面板）或ZQ175DN模型23個月齡（右面板）；CD：對9周齡的R6/2模型（左面板）或23月齡的zQ175DN模型（右面板）整個紋狀體組織中PKR水平以及PKR磷酸化程度的Westernblot分析；E：對9周齡的R6/2和等位基因對照組紋狀體的NeuN（紅色偽彩色）、總PKR（綠色偽彩色）和DAPI（藍色偽彩色）間接免疫熒光染色；F：從R6/2或等位基因對照組紋狀體胞漿提取物中免疫純化PKR后進行與PKR相關的mtRNA的定量PCR。G：在體外培養(yǎng)的14天IPSC衍生的人神經(jīng)元中用DMSO載體對照、30mg/mL干擾素-β(已知誘導PKR陽性的對照處理組)或線粒體氧化磷酸化抑制劑以增加對OXPHOS功能的依賴
結論
本文從特異性細胞轉錄組變化方面研究了突變的亨廷頓蛋白（mHTT）在HD中對神經(jīng)元細胞死亡的影響，發(fā)現(xiàn)HD最脆弱的紋狀體刺狀投射神經(jīng)元中釋放線粒體RNA (mtRNA)(一種強有力的線粒體衍生的天然免疫原)，刺狀投射神經(jīng)元中固有免疫信號上調(diào)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)釋放的mtRNA能夠直接連接固有免疫雙鏈RNA感受器蛋白激酶R(PKR)，僅通過對線粒體功能的化學抑制(不存在mHTT)也足以誘導人神經(jīng)元PKR的表達。研究人員在本文強調(diào)了考慮細胞類型特異性轉錄失調(diào)在HD發(fā)病機制中的重要性，并提出了mHTT導致線粒體失調(diào)與mHTT觸發(fā)mtRNAs釋放引起固有免疫信號激活，進而導致HD神經(jīng)元脆弱性增強的模型。
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