中文字幕理论片,69视频免费在线观看,亚洲成人app,国产1级毛片,刘涛最大尺度戏视频,欧美亚洲美女视频,2021韩国美女仙女屋vip视频

本文由面癱的貓編譯，董小橙、江舜堯編輯。

原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。

原名：Multiplexed identification, quantification and genotyping of infectious agents using a semiconductor biochip

譯名：一種可用于病原體多重檢測、定量和基因分型的半導體生物芯片

期刊：Nature biotechnology

IF：35.724

發(fā)表時間：2018年

通信作者：Arjang Hassibi 

通信作者單位：InSilixa, Inc., Sunnyvale, California, USA

1 核酸檢測分析流程

芯片主要由兩部分組成：DNA生物檢測器陣列（DNA biosensor array）及其上的液體反應(yīng)室（Fluidic chamber）。核酸和多重反應(yīng)試劑進入反應(yīng)室后，在熱循環(huán)模塊的控制下，對感興趣片段（Regions of interest, ROI）進行PCR擴增。因正向引物（p_f）過量、反向引物（p_r）不足，PCR擴增以非對稱方式進行，產(chǎn)生大量正向單鏈DNA（ssDNA）復(fù)制子（a_f）。DNA生物檢測器上包被有反向熒光捕獲探針（Capture probes），可捕獲正向ssDNA復(fù)制子并釋放信號，從而實現(xiàn)對PCR過程的實時監(jiān)測。在實時雜交階段，ssDNA復(fù)制子與特異捕獲探針結(jié)合。在熔解曲線階段，隨溫度升高，復(fù)制子和探針發(fā)生解離并釋放信號。因同一復(fù)制子與野生型（WT probe）和突變型探針（MT probe）的結(jié)合具有熱力學差異，通過對兩者熔解曲線進行分析，能夠?qū)蛭稽c進行突變檢測。

圖1 核酸檢測分析流程

2 反向熒光技術(shù)實現(xiàn)實時能量轉(zhuǎn)換

基于微型芯片實現(xiàn)閉管多重核酸檢測，需要一種基于固相雜交的實時能量轉(zhuǎn)換方法。傳統(tǒng)能量轉(zhuǎn)換方式（光學、電化學或者機電轉(zhuǎn)換）受到諸多限制，譬如，靈敏性不夠高、不適用于高密度陣列或者使用溫度范圍有限。作者采用反向熒光轉(zhuǎn)換技術(shù)（inverse fluorescence transduction，IFT）以克服這些限制。傳統(tǒng)熒光檢測用非熒光探針捕獲熒光標記靶標ssDNA，靶標增加則檢測到的信號升高（圖2a）。在反向熒光技術(shù)中，捕獲探針為熒光集團標記，靶標ssDNA為淬滅集團標記。探針因捕獲到靶標ssDNA而導致熒光集團淬滅，熒光信號減弱（反向）。因反應(yīng)液中包含的是淬滅集團而不是熒光集團，在應(yīng)用反向熒光技術(shù)時，反應(yīng)液對熒光信號檢測的干擾被極大地降低，從而可用于實現(xiàn)對固相雜交陣列的實時光學測量（圖2b，2c）。

作者提出兩種反向熒光策略：（1）在正向引物的5’端標記淬滅集團，通過序列互補使熒光集團和淬滅集團近距離接觸以實現(xiàn)熒光淬滅（圖2b）。（2）用淬滅集團標記dNTP，結(jié)合定制的Taq聚合酶（兼容淬滅集團標記的dNTP）實現(xiàn)復(fù)制子的合成。復(fù)制子的每一個核苷酸上都攜帶一個淬滅集團，從而實現(xiàn)更高效的淬滅反應(yīng)（圖2c）。盡管兩種策略都可實現(xiàn)，但也各有缺點：（1）探針需要特殊設(shè)計以保證熒光集團和淬滅集團能夠近距離作用；（2）dNTP的淬滅集團標記導致合成酶工作效率下降、PCR效率下降。

圖2  DNA探針結(jié)構(gòu)示例，以及反向熒光技術(shù)和傳統(tǒng)熒光技術(shù)檢測點突變時的熔解曲線

3 實時DNA探針設(shè)計

反向熒光探針包括三個部分：（1）錨定接頭（Linker），將探針固定到CMOS芯片上；（2）捕獲探針序列（Capture sequence），由15-35 個核苷酸構(gòu)成，與靶標序列互補配對，以捕獲靶標ssDNA；（3）雙熒光標記（Label），在胸腺嘧啶六聚體兩端分別標記FAM和TAM熒光集團。（圖3a）

相較于傳統(tǒng)單熒光集團標記，雙熒光標記有兩個優(yōu)點：（1）激發(fā)波長和發(fā)射波長相差達到88nm，即由FAM吸收激發(fā)光，由TAM發(fā)出熒光；（2）FAM和TAM都可與淬滅集團相互作用，使淬滅距離更大，淬滅光譜更廣。（圖3a）

圖3  CMOS生物芯片的結(jié)構(gòu)和各組件的微結(jié)構(gòu)

4 CMOS芯片結(jié)構(gòu)

CMOS生物芯片能夠在實時監(jiān)測IFT信號的同時控制液體反應(yīng)室的溫度。外源激發(fā)光透過液體反應(yīng)室的透明塑料蓋，激發(fā)DNA生物探測器上IFT探針發(fā)出熒光。激發(fā)光和熒光透過CMOS層后，激發(fā)光被阻擋，熒光被底層的光電二極管接收并轉(zhuǎn)化為電信號。電信號經(jīng)光電流檢測器（ΣΔ detector，圖3g）放大和數(shù)字化后輸出。熒光檢測系統(tǒng)每秒鐘可檢測1-50次，檢測信號范圍至少為5個數(shù)量級。32×32陣列共有1024個DNA生物檢測器（圖3e）。每個檢測器獨立工作，包被特定的捕獲探針并獨立進行信號檢測。

實現(xiàn)PCR熱循環(huán)和固相熔解曲線分析的溫控系統(tǒng)主要由三部分組成：電阻加熱器件（在PCB層，圖3b）、溫度感應(yīng)器件（CMOS層，圖3c）和散熱器件（基底層，圖3d）。程序化的溫度控制系統(tǒng)，能夠?qū)囟冗M準確測定（±0.3°C）。升降溫速率可達到±4°C/s。

5 多重呼吸道病原檢測和定量

實驗所用呼吸道病原為四種RNA病毒（甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒2型）和兩種DNA病毒（腺病毒C亞屬和E亞屬）。反應(yīng)液為一步法RT-PCR混合液，并加入一份臨床樣本核酸、陽性質(zhì)控核酸和八對淬滅集團標記的引物對。實驗所用芯片的249個像素單元包被有IFT探針。其中一組探針是用于捕獲反向引物，以檢測反向引物的消耗進行擴增曲線測定；另一組探針用于捕獲PCR產(chǎn)物正向復(fù)制子，驗證多重PCR成功進行。每一個探針包被5個像素單元，用作重復(fù)測定。

在病原定量檢測實驗中，作者用5個濃度的甲型流感病毒RNA（100到100000 copies/μl）作為檢測底物，進行3次重復(fù)實驗。通過檢測溶液中流感反向引物的消耗（圖4a）繪制擴增曲線（圖4b），進而估算起始模板濃度。與傳統(tǒng)實時熒光PCR類似，C_t值與濃度的log值呈負相關(guān)（R²= 0.97，C_t= -3.46log₁₀[C] + 40.63）（圖4b）。PCR結(jié)束后，包被復(fù)制子捕獲探針的像素單元可對反應(yīng)液中的復(fù)制子進行特異性熔解曲線分析（圖4c）。

在病原多重檢測實驗中，作者對11份匿名病人樣本進行檢測，每個樣本使用一塊CMOS芯片。只有當擴增曲線（C_t < 40）和熔解曲線（melt area > 0.1）都達到限值時才判斷樣本為陽性。并同時用商業(yè)化試劑盒和儀器對11份樣本進行檢測。CMOS芯片檢測結(jié)果與商業(yè)化檢測方法一直（圖4d, 4e, 4f）。證明該芯片在病原多重檢測結(jié)果具有較高的準確性。

圖4 采用芯片的呼吸道病毒檢測和定量實驗

6 結(jié)核桿菌耐藥位點多重檢測

為了證明CMOS生物芯片的基因分型準確性和其多重檢測能力，作者同時對結(jié)核桿菌（M. tuberculosis，MTB）基因組上16個片段內(nèi)的54個耐藥位點進行檢測。這16個感興趣片段（TB1-TB16）分布在6個不同的基因上，而54個耐藥位點分別與三種抗生素有關(guān)。實驗對14株MTB進行檢測，其中一株為藥敏型WT，另外13株為耐藥型MT。所有MTB序列都經(jīng)二代測序驗證，與表型一致。實驗檢測底物的核酸濃度為大約5000 genomic copies/ 25μl。

本實驗中IFT采用淬滅集團標記dCTP的策略，所以PCR產(chǎn)生的復(fù)制子攜帶大量淬滅集團。實驗所用芯片在678個像素單元上包被了104種IFT探針，用于固相熔解曲線分析以區(qū)分WT和MT。每種探針包被5個像素單元，用作重復(fù)。WT和MT熔解曲線差值的總和用以判斷基因型。正值為野生型，負值為突變型。

實驗結(jié)果顯示，一方面，對WT上所有未突變位點CMOS生物芯片都正確分型；另一方面，對13株MT攜帶的突變位點，CMOS芯片也都成功檢出。值得注意的是，有些突變位點處在二級結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜的高GC區(qū)。（圖5）

為了更好地展示該芯片對SNP檢測的適用范圍，作者介紹了其中兩個SNP的檢測引物的設(shè)計策略。I572F SNP位于TB16復(fù)制子的無規(guī)卷曲段。一個中間帶有SNP的簡短捕獲序列即可成功檢測該SNP（圖6a）。而D94G SNP位于TB1的穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)內(nèi)（T_m> 80°C），探針難以到達。作者根據(jù)局部結(jié)構(gòu)設(shè)計了更為復(fù)雜的捕獲序列，以使探針和復(fù)制子更易結(jié)合（圖6b）。兩個SNP都被成功檢出。

圖5  MTB耐藥突變檢測實驗

圖6  依據(jù)DNA二級結(jié)構(gòu)設(shè)計熔解曲線分析探針示例

作者首先設(shè)計了一種新的實時能量轉(zhuǎn)換技術(shù)（IFT）。采用這一技術(shù)，作者開發(fā)了一塊高度集成的CMOS生物芯片用于核酸檢測和位點分析。該核酸檢測平臺具有快速（小于2h）、精確（擴增曲線定量分析）、多重（受陣列大小和冗余度限制）且同源（閉管）的特點。通過檢測不同濃度的核酸和6種呼吸道病毒（包括DNA和RNA）的核酸，作者證明該芯片具有良好的核酸定量和多重檢測能力。通過對54個耐藥位點的準確檢測，作者證實該芯片不僅能夠檢測病原，還能夠分析病原攜帶的耐藥突變。

作者認為該核酸檢測平臺存在4點不足：（1）因為捕獲探針是基于已知序列，所以此方法只能檢測已知耐藥突變。（2）因為PCR反應(yīng)體系自身的限制，難以分析超過100個感興趣片段。（3）當位點的WT和MT混合出現(xiàn)時，MT比例小于20%時難以準確檢出。（4）此芯片的現(xiàn)場使用需要再進一步集成核酸提取系統(tǒng)。

小編以為，一塊小芯片在2小時內(nèi)，不僅對病原進行多重檢測、定量檢測，還可檢出病原攜帶的耐藥突變，簡直是精準醫(yī)療時代的必備佳品。與多重檢測和定量檢測相比，耐藥突變檢測才是本芯片的最大亮點。2小時以內(nèi)出結(jié)果，比傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比（大約24h）提高了一個數(shù)量級，即使與二代測序相比（不少于12h）也加快了很多。但一個芯片只能檢測一個樣本，顯然與它應(yīng)有的逼格不符。期待作者團隊未來新作！

評價部分僅屬小編的個人觀點，歡迎大家點贊評論。小編愿與大家一起進步！