下呼吸道感染（LRTIs）是兒科的常見疾病，威脅著兒童的生命健康。由于病原混合感染普遍存在，且不同病原之間引起的臨床癥狀有時十分相似，因此，及時、準(zhǔn)確和全面的病原學(xué)檢測具有重要意義。在普通的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）發(fā)展起來的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即多重 PCR，能夠在同一標(biāo)本和同一反應(yīng)體系中檢測多種病原。因此多重 PCR 一經(jīng)提出后便得到廣泛的應(yīng)用，并且結(jié)合不同的技術(shù)已衍生出不同類型的多重 PCR。
在普通PCR 基礎(chǔ)上，針對不同的靶DNA 加入了多對特異性引物，使其能在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行多個靶標(biāo)擴(kuò)增，最后通過一定的手段實現(xiàn)了多靶標(biāo)檢測。多重PCR 基本原理與常規(guī) PCR 相同，不過多重 PCR 反應(yīng)體系的組成和 PCR 循環(huán)的條件需要經(jīng)過優(yōu)化以確保同時擴(kuò)增幾個片段。理論上只要 PCR 擴(kuò)增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限，但由于各種條件的限制，實際能夠擴(kuò)增的引物對數(shù)量是有限的。圖1：多重PCR的原理
巢式PCR使用兩對引物分兩步進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。在第一階段，第一對引物為外引物，可對靶序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，起到靶序列富集的作用。接著，第二對引物作為內(nèi)引物，可結(jié)合在第一階段PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部，并進(jìn)行第二階段的 PCR 擴(kuò)增，起到信號放大作用。經(jīng)過兩個階段的PCR 擴(kuò)增，不僅提高了敏感性，還提高了特異性。多重巢式 PCR 則是結(jié)合了巢式PCR 和多重 PCR 而產(chǎn)生的。國內(nèi)的一項可同時檢測呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）、鼻病毒（Human rhinovirus，HRV）、偏肺病毒（Human metapneumovirus，HMPV）的多重巢式 PCR 研究發(fā)現(xiàn)，多重巢式 PCR 與實時定量 PCR 相比較具有更高的敏感性，且與其他常見呼吸道病毒無交叉反應(yīng)。靶序列富集多重 PCR（Target enriched multiplex PCR，Tem-PCR）是由韓健博士基于Templex技術(shù)改良的多重巢式PCR。與多重巢式PCR相同的是，Tem-PCR對每一個靶序列都設(shè)計了兩對特異的內(nèi)、外引物，不同的是，內(nèi)引物5’端具有一串能被超級引物識別的序列，且反向超級引物帶有生物素標(biāo)記。Tem-PCR 先通過較低濃度的兩對特異的內(nèi)、外引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而起到靶序列富集作用，再加入超級引物，與內(nèi)引物5’端配對結(jié)合并進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，最后對具有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
實時熒光定量 PCR 主要通過熒光染料、Taq Man 探針或分子信標(biāo)等在PCR 反應(yīng)中對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后根據(jù)熒光信號與擴(kuò)增曲線的關(guān)系，來計算出病原的核酸載量。熒光染料可結(jié)合在雙鏈DNA 的小溝上并發(fā)出強(qiáng)的熒光信號，且被檢測到的熒光信號越強(qiáng)，代表擴(kuò)增的雙鏈 DNA 越多。雖然熒光染料簡便，不需專門設(shè)計探針便可進(jìn)行熒光標(biāo)記，但也因其可與任何雙鏈DNA 結(jié)合，使得缺乏特異性。因此，單純使用熒光染料是無法實現(xiàn)多重檢測的，還需與高分辨熔解曲線技術(shù)結(jié)合。高分辨熔解曲線技術(shù)利用不同的DNA 具有不同熔解溫度的特征，通過調(diào)節(jié)溫度變化，使得DNA 變性解鏈，再通過熒光信號的變化來檢測不同的DNA。Taq Man 探針是一種能結(jié)合在相應(yīng)靶標(biāo)的熒光探針，其 5’端帶有一個熒光集團(tuán)，3’端帶有一個淬滅基團(tuán)。完整的Taq Man 探針因兩基團(tuán)距離相近，使得熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)淬滅，只有在PCR 擴(kuò)增過程中，Taq Man 探針被DNA聚合酶降解，兩基團(tuán)分離后才可發(fā)出熒光。因此，基于Taq Man探針的多重 PCR 是根據(jù)不同靶標(biāo)設(shè)計不同的探針，而不同的探針具有不同的熒光基團(tuán)，通過檢測其不同熒光信號而實現(xiàn)多重檢測的。分子信標(biāo)與Taq Man 探針一樣兩端分別具有熒光集團(tuán)和淬滅基團(tuán)，不一樣的是分子信標(biāo)不是線性探針，而呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。探針兩端互補(bǔ)結(jié)合為莖部，中間為環(huán)部可與相應(yīng)靶標(biāo)結(jié)合。PCR反應(yīng)中無相應(yīng)靶標(biāo)時，分子信標(biāo)呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光集團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)淬滅；而當(dāng)反應(yīng)中存在相應(yīng)靶標(biāo)時，分子信標(biāo)可打開形成單鏈與相應(yīng)靶標(biāo)結(jié)合，兩基團(tuán)也因此分離而得以發(fā)出熒光。由于分子信標(biāo)從莖環(huán)結(jié)構(gòu)變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)需要一定的力，故其特異性較Taq Man 探針強(qiáng)。
MLPA技術(shù)針對每個病原的靶序列都設(shè)計了一對探針，包括短探針和長探針（見圖2）。短探針3’端的序列可與靶序列互補(bǔ)，5’端的序列可與通用引物A互補(bǔ)；而長探針5’端的序列可與靶序列互補(bǔ)，3’端的序列可與通用引物B互補(bǔ)，兩端序列中間還含有一段具有長度特異性的填充序列。在進(jìn)行PCR反應(yīng)時，只有長、短探針都與靶序列結(jié)合，才能被DNA連接酶連接成為DNA單鏈。不同病原對應(yīng)的長、短探針都按照上述流程連接完好后，再加入通用引物A和通用引物B，便可對所有病原的靶序列同時進(jìn)行擴(kuò)增。由于不同病原的靶序列對應(yīng)的填充序列長度不同，因此不同病原擴(kuò)增出來的DNA長度具有特異性，可通過電泳技術(shù)進(jìn)行檢測區(qū)分。圖2：多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)MLPAA：與通用引物A互補(bǔ)的序列；B：與通用引物B互補(bǔ)的序列；X：具有長度特異性的填充序列
2008年，Martin Reijans 首次將 MLPA技術(shù)應(yīng)用到呼吸道病毒的檢測上，使得15 種呼吸道病毒可在同一反應(yīng)體系中在一個工作日內(nèi)完成檢測，且其敏感性和特異性也經(jīng)培養(yǎng)法和呼吸道合胞病毒免疫層析法得到了良好的驗證。Kenza
Hattoufi 利用 MLPA 技術(shù)同時檢測18種呼吸道病毒、2種細(xì)菌和2種非典型病原體，發(fā)現(xiàn)嬰兒急性呼吸道感染大多數(shù)是由病毒引起。因此，如果 MLPA 技術(shù)常規(guī)應(yīng)用于兒童呼吸道感染的病原學(xué)檢測中，可能會減少兒科醫(yī)生對抗生素的使用。
微流控技術(shù)是新一代床旁即時檢驗（Point of care testing，POCT）的關(guān)鍵技術(shù)?；谖⒘骺氐亩嘀?PCR 可通過數(shù)十至數(shù)百微米的管道精確操縱和處理液體，并將核酸的提取、PCR 擴(kuò)增以及檢測等步驟都濃縮集成在一張芯片中，各個步驟在芯片上的不同區(qū)域進(jìn)行，互不干擾。黃恩奇等人發(fā)明的 Onestart 系統(tǒng)，是一種新型的基于微流控的多重 PCR 檢測系統(tǒng)，其病原學(xué)檢測所需的試劑都已預(yù)裝在芯片中，因此在檢測過程中無需手動轉(zhuǎn)移液體或加用反應(yīng)試劑，減少了人員的操作，從而避免了因人員技術(shù)水平差異而出現(xiàn)錯誤的問題。Onestart系統(tǒng)可在1.5小時內(nèi)完成包括新型冠狀病毒在內(nèi)19種病毒和2種非典型病原體的檢測，且檢測結(jié)果與實時熒光定量PCR具有良好的一致性。
Kary.
B. Mullis 提出的 PCR是第一代 PCR，在此基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記的實時熒光定量PCR 是第二代 PCR，雖然可對核酸進(jìn)行定量，但都只是依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量，而作為第三代 PCR 的數(shù)字PCR 可對核酸進(jìn)行絕對定量。數(shù)字PCR 是將原始的核酸樣本通過有限稀釋分成成千上萬個子樣本，而每個子樣本中含有 1 個或 0 個靶核酸。每個子樣本分別通過 PCR 擴(kuò)增，最后通過檢測陽性的子樣本，并根據(jù)泊松分布，進(jìn)而計算出靶核酸的拷貝數(shù)。數(shù)字 PCR 利用不同靶核酸的所標(biāo)記的熒光顏色不同或其熒光強(qiáng)度不同，又或利用高分辨熔解曲線可實現(xiàn)核酸的多重檢測。
隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，多重 PCR 結(jié)合不同的技術(shù)已衍生出不同類型的多重PCR，不同類型的多重 PCR具有不同的特點(diǎn)，臨床醫(yī)生及檢驗人員可根據(jù)臨床具體情況選擇合適類型的多重PCR，進(jìn)而為 LRTIs 兒童提供針對性的治療。
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