摘要：病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢驗(yàn)技術(shù)也在不斷發(fā)展前進(jìn)著。目前，應(yīng)用比較廣泛的病原微生物檢測(cè)方法主要有直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、核酸分子雜交、基因芯片、多聚酶鏈反應(yīng)等，本文對(duì)這些檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展做一綜述。
對(duì)人和動(dòng)物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細(xì)菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、癡呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來出現(xiàn)的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強(qiáng)，往往造成世界性大流行，因此對(duì)病原體的檢測(cè)必須做到快速、準(zhǔn)確。常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)方法操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，而且對(duì)操作人員技術(shù)水平要求比較高。隨著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，病原學(xué)診斷已不再局限于病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測(cè)手段不斷出現(xiàn)并被應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)室。核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等檢測(cè)方法，自動(dòng)化程度高，快速省時(shí)、無污染、結(jié)果精確，可以準(zhǔn)確靈敏地鑒定病原微生物。
1 傳統(tǒng)的病原微生物的檢測(cè)方法
傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查以染色、培養(yǎng)、生化鑒定等為主，將標(biāo)本直接涂片染色鏡檢和接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)是對(duì)細(xì)菌或真菌感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷的常用方法。
1．1 直接涂片染色鏡檢
病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色后可借助顯微鏡觀察其大小、形態(tài)、排列等。直接涂片染色鏡檢簡(jiǎn)便快速，對(duì)那些具有特殊形態(tài)的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結(jié)核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接涂片鏡檢不需要特殊的儀器和設(shè)備，在基層實(shí)驗(yàn)室里仍然是十分重要的病原微生物檢測(cè)手段。
1．2 分離培養(yǎng)與生化反應(yīng)
分離培養(yǎng)主要用于臨床標(biāo)本(如血液、痰、糞便等)或培養(yǎng)物中有多種細(xì)菌時(shí)對(duì)某一種細(xì)菌的分離。細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖需要一定時(shí)間，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不能同時(shí)處理批量樣本。為解決這一問題，各種自動(dòng)化培養(yǎng)和鑒定系統(tǒng)不斷產(chǎn)生，傳統(tǒng)鑒定方法也在逐步改進(jìn)，大大加快了檢驗(yàn)速度。
1．3 組織細(xì)胞培養(yǎng)
活組織細(xì)胞培養(yǎng)適于專營(yíng)活組織細(xì)胞內(nèi)生存的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細(xì)胞是不一樣的，將活細(xì)胞從病原體敏感的動(dòng)物組織中取出在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)或用病原體敏感細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)，再將病原體接種于相應(yīng)的組織細(xì)胞中后，病原體可在其中繁殖增長(zhǎng)，引起特異性的細(xì)胞病變效應(yīng)。也可以將病原體直接接種于敏感動(dòng)物體內(nèi)，引起相應(yīng)組織器官出現(xiàn)特異的病理學(xué)改變。往往可以根據(jù)這些特異的病變對(duì)病原體進(jìn)行鑒定。
2 血清學(xué)與免疫學(xué)檢測(cè)
血清學(xué)檢測(cè)是通過已知的抗體或抗原來檢測(cè)病原體的抗原或抗體從而對(duì)病原體進(jìn)行快速鑒定的技術(shù)，簡(jiǎn)化了鑒定步驟，常用的方法包括血清凝集技術(shù)、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)、熒光抗體檢測(cè)技術(shù)、協(xié)同凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)等。酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用大大提高了血清學(xué)檢測(cè)的敏感性和特異性，不僅可檢測(cè)樣本中病原體抗原，也可檢測(cè)機(jī)體的抗體成分。幽門螺奸菌在我國(guó)人群感染率高達(dá)50％ ～80％ ，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結(jié)果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國(guó)人群中感染率極高，ELISA應(yīng)用于乙型肝炎病人早期血清學(xué)診斷的效果最為明顯。
臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細(xì)菌中分離出目標(biāo)菌是關(guān)鍵。
3 基因檢測(cè)
隨著科技水平發(fā)展，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)日新月異，對(duì)病原微生物的鑒定已不再局限于對(duì)普通外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特性等的一般檢驗(yàn)上，而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別于其他種或?qū)?，檢測(cè)其特有的基因片段序列可用來鑒別病原微生物。隨著科技的發(fā)展，基因檢測(cè)技術(shù)逐漸代替其它檢測(cè)技術(shù)，成為臨床檢驗(yàn)科和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原體的主流檢測(cè)技術(shù)。
3．1 核酸雜交技術(shù)
具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締成異質(zhì)雙鏈的過程叫核酸雜交，其雜交雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。在病原微生物檢測(cè)中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細(xì)胞中分離出來，純化后在體外結(jié)合到一定的固相支持物上，與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。核酸原位雜交是指標(biāo)記的核酸探針直接與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交。探針還可以用熒光標(biāo)記，在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置。核酸分子雜交檢測(cè)技術(shù)與其它方法相比顯著地優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、敏感、快速、特異。Wong 等用熒光標(biāo)記2個(gè)不同的寡核苷酸探針從血液標(biāo)本中檢測(cè)出假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌，最低檢測(cè)限為10 cfu·mL～，特異度為100％ ，檢測(cè)時(shí)間不到2 h。寡核苷酸探針是針對(duì)病原體特異基因序列設(shè)計(jì)的，可以將待檢測(cè)的病原體定位在不同的分類等級(jí)，如科、屬、種、亞種“ 。（病原微生物檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展）
3．2 基因芯片技術(shù)
基因芯片(DNA chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)或DNA芯片，是生物芯片的一種，是核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展延伸而來的。通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)甚至百萬計(jì)的基因探針即DNA片段有規(guī)律地排列成二維DNA探針陣列，固定到硅片、玻片等固態(tài)支持物上，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行核酸雜交，用于基因檢測(cè)工作。其測(cè)序原理與核酸雜交一樣，但解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)操作繁雜、檢測(cè)效率低、自動(dòng)化程度不高的缺點(diǎn)?；蛐酒诓≡⑸锔腥驹\斷上的應(yīng)用，大大縮短了確診所需要的時(shí)間，而且能檢測(cè)出病原體是否耐藥、對(duì)那些抗生素耐藥、對(duì)那些抗生素敏感?；蛐酒夹g(shù)同樣還有些問題有待解決，如提高芯片的特異性和檢測(cè)信號(hào)的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多數(shù)芯片都需要昂貴的檢測(cè)儀器，這些問題使得基因芯片到目前主要局限于實(shí)驗(yàn)室研究而未能廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物的檢測(cè)與鑒定。
3.3 PCR技術(shù)
聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導(dǎo)未知片段中微量待測(cè)基因片段并進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。由于PCR可以對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，特別適用于病原體感染早期的診斷，但是如果引物特異性不強(qiáng)，可能會(huì)造成假陽性的出現(xiàn)。PCR技術(shù)在近20年里發(fā)展迅速，從基因擴(kuò)增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，可同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，適合大量樣本的分析與鑒定。
多重PCR具有：(1)高效性，在同一反應(yīng)體系內(nèi)可同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)ν徊≡⑸锏牟煌蛣e進(jìn)行分型；(2)系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測(cè)，如幾種肝炎病毒同時(shí)感染；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染；需特殊培養(yǎng)的無芽胞厭氧菌感染；破傷風(fēng)桿菌，炭疽桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰(zhàn)傷感染細(xì)菌感染；(3)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)被檢出，節(jié)省試劑、節(jié)約費(fèi)用、節(jié)省時(shí)間，為臨床提供更快更多更準(zhǔn)確的診斷信息。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)性病病原體早期確診、窗口期篩查、療效檢測(cè)、基因變異分析和預(yù)后評(píng)估等具有重要價(jià)值，為流行病學(xué)調(diào)查提供幫助。熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性引物可準(zhǔn)確反映病原體感染和藥物療效，特別適用于不可人工培養(yǎng)和難以培養(yǎng)的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷。
基因芯片技術(shù)與多重PCR結(jié)合可以通過PCR對(duì)目的基因進(jìn)行放大，通過基因芯片的熒光探針增加檢測(cè)的靈敏性和特異性，使得兩種檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，已廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)。將病原體特異性基因作為靶基因設(shè)計(jì)出引物與探針，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，制備出寡核苷酸芯片，再對(duì)待測(cè)樣本靶基因進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與病原菌多重PCR基因芯片檢測(cè)體系雜交，可根據(jù)雜交信號(hào)直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。
3．4 等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)
分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，各種新的基因檢測(cè)手段不斷出現(xiàn)。PCR在應(yīng)用時(shí)也是存在一些缺陷，比如需要反復(fù)變溫，反應(yīng)時(shí)間還是較長(zhǎng)，儀器的要求還是較高，這時(shí)就出現(xiàn)了等溫核酸檢測(cè)技術(shù)，蘇州先達(dá)基因公司研發(fā)團(tuán)隊(duì)研發(fā)了具有全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，酶促重組等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ERA技術(shù)）。憑借其技術(shù)在核酸檢測(cè)領(lǐng)域開發(fā)了三大核心，1、體溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能在恒溫條件下，將痕量的核酸模板擴(kuò)增到可以檢出的水平；2、單分子熒光檢測(cè)技術(shù)，集恒溫?cái)U(kuò)增與熒光信號(hào)檢測(cè)于一體，可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)檢測(cè)；3、核酸快速釋放技術(shù)，為實(shí)驗(yàn)節(jié)省更多的時(shí)間。該方法低溫條件下（25-42℃）可對(duì)痕量的靶DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，在最適溫度35-40℃時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間僅需15分鐘，其低溫適應(yīng)性和靈敏度等方面取得了重大突破并達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，而且擺脫國(guó)外專利壁壘，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌、副溶血性弧菌、李斯特氏菌等病原體檢測(cè)。
4 小結(jié)與展望
對(duì)病原體進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)和鑒定是傳染病防治工作的首要問題。隨著生物學(xué)研究由宏觀領(lǐng)域向微觀領(lǐng)域的發(fā)展，病原體檢測(cè)方法也從組織形態(tài)學(xué)水平深入到分子水平、基因水平。近年來發(fā)展起來的病原微生物高通量檢測(cè)技術(shù)樣本需要量少、快速省時(shí)、無污染、診斷結(jié)果精確、自動(dòng)化程度高，相信隨著研究的不斷進(jìn)展和深入，這些高通量診斷技術(shù)和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來越重要的作用，而多種檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)合和綜合更是有著廣闊的應(yīng)用前景。
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