摘 要
DNA甲基化是哺乳動物中研究最為深入的表觀遺傳修飾之一。正常細胞中，DNA 甲基化有效的調控基因表達水平。某些抑癌基因的失活是由于啟動子區(qū)域的高甲基化，大量實驗研究表明，在多種類型癌癥中，DNA甲基化導致了大范圍的基因沉默。除了啟動子區(qū)域和DNA重復序列中的甲基化水平改變外，甲基化還與非編碼RNA（如腫瘤抑制作用相關的microRNA）的表達調控有關。
DNA甲基化水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的聯系，鼓勵著我們不斷的解碼人類表觀基因組。甲基化測序是研究不同生命過程中基因調控的一個重要工具，例如細胞分化和疾病進展，并且越來越多的應用到包括腫瘤早篩、診斷等臨床檢測中。全基因組甲基化測序（WGBS）允許無偏好性的進行單堿基分辨率檢測，是理想的檢測目標區(qū)域方法。當您想進一步研究感興趣的目標基因組區(qū)域，經過雜交捕獲后再測序，這種有針對性的甲基化測序檢測方案成本更低。特別地，在評估具有低水平甲基化特征的復雜樣本時（如液體活檢中的游離DNA），一般需比常規(guī)全基因組甲基化測序達到更高的測序深度，雜交捕獲成為理想的實驗方案。
什么是甲基化
在哺乳動物中，負責5-甲基胞嘧啶（5mC）形成的DNA甲基轉移酶包括DNMT1，DNMT3A及DNMT3B。DNMT1酶可以識別半甲基化的DNA，并保證維持現有的甲基化模式；DNMT3A和DNMT3B會在未甲基化的胞嘧啶上添加甲基基團。除了5-甲基胞嘧啶（5mC），5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）為已發(fā)現胞嘧啶的甲基化中間產物，與5-甲基胞嘧啶（5mC）都為哺乳動物基因組中發(fā)現的兩種最常見的表觀遺傳標記，通過雙加氧酶家族TET（包括TET1、TET2和TET3）蛋白，將5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）[2]。DNA的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）水平，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。
甲基化與癌癥
癌癥的發(fā)生、發(fā)展伴隨著DNA甲基化模式的改變，包括了逆轉錄元件、著絲粒及原癌基因的DNA低甲基化，以及與基因抑制相關的關鍵基因調控元件（如遠端增強子和啟動子轉錄起始的重疊區(qū)域）的甲基化。如下圖所示，在整個基因組的所有基因調控元件，正常細胞和癌癥細胞之間的DNA甲基化模式存在廣泛差異。正?；蚪M中的大部分CpG位點都攜帶著5mC，而遠端增強子元件及CpG島區(qū)域對甲基轉移酶DNMT的活性具有抗性。癌細胞主要表現特征為整體范圍的失去甲基化遺傳學修飾，反而增強子和啟動子區(qū)域內出現異常的甲基化位點。這種甲基化分布的改變，導致了腫瘤抑癌基因的表達受抑制，并伴隨著原癌基因表達的增加，從而進一步推動了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。（在下圖中，白色圓圈代表未甲基化CpG位點；黑色圓圈代表甲基化CpG位點[1]）。
DNA甲基化為常見的腫瘤標志物
甲基化檢測應用
2020年6月，GRAIL在歐洲腫瘤學會（ESMO）旗下期刊《腫瘤學年鑒》（Annals of Oncology）發(fā)表了CCGA（Circulating Cell-free Genome Atlas，CCGA）的三個子項目實驗結果。在CCGA1的原理發(fā)現階段，使用訓練集樣本1785例及驗證集樣本1015例，同時對三種不同的高通量測序（NGS）方案進行評估，包括了靶向測序、全基因組測序（拷貝數變異，CNV）及全基因組亞硫酸氫鹽測序 （WGBS）。驗證結果證明， 相比于DNA突變水平檢測，WGBS技術路線更適合應用于癌癥早篩的研究領域[6]。GRAIL也同時公布了其結合機器學習算法的cfDNA的甲基化測序分析技術可以同時檢測五十多種癌癥類型，其檢測的特異性>99%，并且對腫瘤信號組織來源的預測準確性>90%[6]。由于CCGA是一項病例對照研究，可能無法真實的反映該血液檢測在普通人群篩查情況下的表現。目前，研究團隊仍在持續(xù)進行PATHFINDER實驗，通過納入更多的健康人群，以評估檢測方案在臨床護理環(huán)境中的實施及性能。
甲基化應用的另一個方向為MRD（Minimal Residual Disease），即微小殘留病灶(是指癌癥治療后殘留在體內的少量癌細胞（對治療無反應或耐藥的癌細胞））。2021年4月，《臨床腫瘤研究》（Clinical Cancer Research）在線發(fā)表了名為《Minimal Residual Disease Detection using a Plasma-only Circulating Tumor DNA Assay in Patients with Colorectal Cancer》文章，Guardant Reveal首次公開了僅使用血漿ctDNA MRD的檢測數據，證明MRD檢測靈敏度達到91%，特異性達100%。Guardant Reveal的MRD技術路線是Tumor-agnostic策略，又稱為Tumor-uninformed，即僅依賴于血漿ctDNA進行MRD檢測（無需組織活檢），檢測方案為整合ctDNA突變（LOD為0.01％ctDNA）及ctDNA甲基化水平檢測（見下圖）。該研究表明，通過整合表觀基因組標記，如DNA甲基化分析，比單獨基因組水平突變檢測靈敏度更高[7]。
甲基化檢測之NGS方法及流程
重亞硫酸氫鹽處理一直是繪制DNA甲基化圖譜的金標準，由來自澳大利亞的Kanematsu等科學家開發(fā)的技術方案[10，11]，DNA經重亞硫酸氫鹽處理后，其胞嘧啶殘基轉化為尿嘧啶殘基，5-甲基胞嘧啶（5mC）則保持不變，各檢測方案對比見下表[9]：
1
重亞硫酸鹽處理后所產生的損傷DNA模版， 其中有一定的比例無法結合引物，從而降低了測序文庫的分子復雜度；
2
隨機擴增有著模版偏好性。
值得注意的是，PBAT方案的改良版本也一直用于單細胞甲基化分析方案中。
總 結
甲基化測序是研究不同生命過程中基因調控的一個重要工具，例如細胞分化和疾病進展，并且越來越多的應用到包括腫瘤早篩、分診、治療選擇、微小殘留監(jiān)測、復發(fā)檢測等臨床領域中。包括游離核酸在內的體液樣本，含有來自于腫瘤的特異的DNA甲基化信號，作為生物標志物樣本檢測來源，無疑是一個絕佳的選擇。
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參考資料：
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