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隨著高通量測序技術(shù)（NGS）技術(shù)的發(fā)展，使我們能夠從全基因組水平來分析5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，由此能夠發(fā)現(xiàn)很多傳統(tǒng)的基因組學研究所不能發(fā)現(xiàn)的東西，這就是所謂的“DNA甲基化測序”！

DNA甲基化測序方法按原理可以分成三大類：

1、重亞硫酸鹽測序；

2、基于限制性內(nèi)切酶的測序；

3、靶向富集甲基化位點測序；

DNA甲基化測序常用方法

基于以上原理又有數(shù)種不同的測序方法，下面，就介紹10種DNA甲基化測序的常用方法及參考文獻：

1) 重亞硫酸鹽測序

該方法可以從單個堿基水平分析基因組中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重煙硫酸鹽對基因組DNA進行處理，將未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶。而發(fā)生了甲基化的胞嘧啶未發(fā)生脫氨基，因而，可以基于此將經(jīng)重亞硫酸鹽處理的和未處理的測序樣本進行比較來發(fā)現(xiàn)甲基化的位點。

【相關(guān)文獻】

Shotgun bisulphite sequencing of theArabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.

Highly integrated single-base resolutionmaps of the epigenome in Arabidopsis

2）重亞硫酸鹽處理后接頭標記技術(shù)(PBAT)

為了避免重亞硫酸鹽處理時模板的丟失，通常會在重亞硫酸鹽處理后進行接頭連接和隨機引物的擴增。

【相關(guān)文獻】

Amplification-free whole-genome bisulfitesequencing by post-bisulfite adaptor tagging

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16224102

3）限制性內(nèi)切酶-重亞硫酸鹽靶向測序(RRBS)

該技術(shù)是指對基因組上CpG島或CpG甲基化較密集的區(qū)域進行靶向測序。樣本首先經(jīng)幾種限制酶進行消化處理，然后經(jīng)重亞硫酸鹽處理，最后再測序。這種方法可以發(fā)現(xiàn)單個核苷酸水平的甲基化。

【相關(guān)文獻】

Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.

http://nar.oxfordjournals.org/content/33/18/5868.long

4）氧化-重亞硫酸鹽測序(oxBS-Seq)

5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)是5’甲基胞嘧啶脫甲基成胞嘧啶過程的中間產(chǎn)物，重亞硫酸鹽測序無法對二者進行區(qū)分。通過氧化-重亞硫酸鹽測序，5’甲基胞嘧啶保留，而5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，進而脫氨基成尿嘧啶。通過將經(jīng)過氧化處理和未處理的樣本進行測序比較，即可從單個堿基水平分辨5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)和5’甲基胞嘧啶。

【相關(guān)文獻】

Quantitative sequencing of 5-formylcytosinein DNA at single-base resolution.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4188980/pdf/emss-60510.pdf

5）TET輔助的重亞硫酸鹽測序(TAB-seq)

TAB-seq采用葡萄糖亞胺與5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)作用來保護免受TET蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脫氨基成尿嘧啶，進而可以從單個堿基水平鑒定5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)。

【相關(guān)文獻】

Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the Mammalian genome

6）甲基化敏感性的限制酶測序(MRE-Seq)

MRE-Seq將甲基化作用的敏感性和限制酶的特異性結(jié)合起來進而鑒定CpG島的甲基化狀態(tài)。

【相關(guān)文獻】

Genome-scale DNA methylation analysis

7）HELP-Seq

HELP-Seq采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶MSPI處理，來對基因組內(nèi)及基因組間的甲基化位點進行比較，進而實現(xiàn)甲基化測序。

【相關(guān)文獻】

Comparative isoschizomer profiling ofcytosine methylation: the HELP assay

8）甲基化DNA免疫共沉淀測序(MeDIP)

MeDIP是一種采用抗體或甲基化DNA結(jié)合蛋白來捕獲富集甲基化DNA的技術(shù)，這種技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域，如CpG島，但不能進行單個堿基水平的分析。

【相關(guān)文獻】

Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal andtransformed human cells

9)甲基化結(jié)合域捕獲技術(shù)(MBD-CAP)

MBD-CAP技術(shù)利用甲基化DNA能夠結(jié)合蛋白MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI來對甲基化的DNA進行免疫沉淀。與MeDIP技術(shù)相似，該技術(shù)也是可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域，不能從單個堿基水平分析甲基化。

【相關(guān)文獻】

High-resolution mapping of DNAhypermethylation and hypomethylation in lung cancer

10）基于探針的靶向富集技術(shù)

甲基化測序靶向富集技術(shù)采用合成寡核苷酸探針來捕獲CpG島、基因啟動子區(qū)域以及其他一些顯著性甲基化的區(qū)域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有這種商品化的試劑盒。

最后，Pacific Biosciences（Pacbio）公司的這項SMRT DNA測序技術(shù)采用動力學原理來直接檢測甲基化的胞嘧啶。

甲基化研究方法——甲基化PCR

接下來，就用一個簡單的方法說明甲基化研究究竟多么不在話下！也許有的小伙伴已經(jīng)猜到了，今天要講的就是甲基化PCR！這種方法靈敏度高，無需特殊儀器，關(guān)鍵是經(jīng)濟實用，是目前應用最為廣泛的檢測方法。

然而小伙伴們要注意的事，甲基化PCR是環(huán)環(huán)相扣的，你從預測甲基化位點設計引物到最后的每一步都要小心！甚至在最后PCR的時候，點樣的順序都是和WESTERN BLOT一樣有講究的！

第一步 在線引物設計：http://www.urogene.org/methprimer/

把你基因的啟動子序列拷貝至此

坐等結(jié)果，它會預測甲基化位點并設計好甲基化引物（很多對引物供你選擇，當然你還要根據(jù)設計出來的引物的退火溫度是否合理之類的進行篩減），如此智能，拿做己用最為省心了！

第二步 基因組DNA的提取。

這一步完全可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，大神們自己配試劑提取完全可以。此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。

使用兩者的注意事項：

1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。

第三步 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA（也可直接購買試劑盒）

原理：亞硫酸氫鈉處理后，DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，通過設計出來的特異性甲基化引物和非甲基化引物對PCR取得條帶的亮度比較來判斷序列是否被甲基化。

大神們請繼續(xù)自配試劑使用~~（后末附有自配試劑與使用步驟，需要請自行查看）

最后一步 PCR 就不再贅述啦~~

最終如果與預期相符的話，會有如例圖所示的結(jié)果，M代表甲基化引物，U代表非甲基化引物，1和2分別是肺癌組織和正常組織所提取的基因組?？梢娫诜伟┙M織中甲基化程度明顯偏高。

圖片引自：Xu Zhai, Shi-Jun Li. Methylation of RASSF1A and CDH13 Genes in Individualized Chemotherapy for Patients with Non-small CellLung Cancer. Asian Pac J Cancer Prev, 15 (12), 4925-4928

這樣的檢測并不局限于組織，經(jīng)過藥品（如甲基化抑制劑）處理后的腫瘤細胞與未處理的細胞比較某基因甲基化程度也是可行的。另外，小伙伴們?nèi)绻诸^樣本量夠大，可以不局限于比較癌組織和癌旁組織的差異，不妨對癌組織樣本分期，或者對病人分類（如初發(fā)腫瘤和復發(fā)腫瘤病人）來檢測有無甲基化差異，也許結(jié)果會有驚喜！

附：自配試劑的使用步驟及注意事項

1：將約2 ug DNA于1.5 ml EP管中使用DDW稀釋至50 ul；

2：加5.5 ul新鮮配制的3 M NaOH；

3： 42℃水浴30 min；

水浴期間配制：

4：10 mM對苯二酚（氫醌），加30 ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）

5： 3.6 M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88 g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3 M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5 ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準確為5.0。加520 ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。

7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。

8：50℃避光水浴16 h。

（時間安排小tip:此步可以在4 pm開始做，熟練的話不到5 pm即可完成，水浴16 h正好至次日8 am以后收，這樣不用熬夜時間的安排是多么讓人心曠神怡。）

注意事項：

1：基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾最多可至4 ug。

2：所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過關(guān)，既要快，又要精確。

3：亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會影響后續(xù)純化吸收。

4：水浴最好達16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不完全。