隨著分子醫(yī)學(xué)和靶向藥物研究的發(fā)展，肺癌的治療已經(jīng)進(jìn)入到個體化治療的階段。伴有基因突變的不可手術(shù)晚期非小細(xì)胞肺癌患者接受TKI靶向藥物治療，其療效顯著優(yōu)于含鉑化療，能很大程度改善患者的生活質(zhì)量。 準(zhǔn)確地檢測出基因突變型或融合是選擇合適靶向藥物的重要前提，而標(biāo)本的質(zhì)量顯著影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，標(biāo)本質(zhì)量不佳是造成假陰性結(jié)果的主要原因，因此在檢測前對標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)量評估能有效避免這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，從而獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，使患者最大程度受益。 對于肺癌的基因檢測目前常用的方法：二代測序 (NGS)、PCR技術(shù)、Sanger法、熒光原位雜交 (FISH)等。然而，每種方法各有利弊。 二代測序 (NGS)：單獨 NGS 分析并不能檢出所有類型的改變，重要的是熟悉單獨分析或聯(lián)合分析可識別的改變類型。對于廣泛檢測無可識別的驅(qū)動癌基因的患者（尤其是從不吸煙的患者），可考慮基于 RNA 的 NGS（如果尚未進(jìn)行），以最大程度檢測融合事件。 PCR可高度針對性地使用（針對特定突變），但該技術(shù)只能針對特定的改變進(jìn)行檢測評估。 Sanger測序，要求最大程度的腫瘤富集。未改良的Sanger測序不適合檢測富集后腫瘤標(biāo)本中腫瘤仍不足25%-30%的突變檢測。更為重要的是Sanger測序不適于檢測識別亞克隆事件（如耐藥突變）。 FISH檢測主要用于拷貝數(shù)、擴(kuò)增以及結(jié)構(gòu)改變?nèi)缁蛑嘏诺确治鰴z查。 接下來，以肺癌為例對各個靶點進(jìn)行梳理。 EGFR基因 01 EGFR 是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域的激活對癌細(xì)胞的增殖、生長的相關(guān)信號傳遞，具有重要意義。中國肺腺癌患者EGFR突變率在40-60%，美國患者約10%；但是在純肺鱗癌中，中美患者突變率＜4%。EGFR中最常見的突變（外顯子19 缺失，外顯子21中的 p.L858R 點突變），EGFR少見突變約占10%（即外顯子 19插入、 p.L861Q、 p.G719X、 p.S768I），其與EGFR 酪氨酸激酶抑制劑 (TKI) 治療的療效相關(guān)。此外，20外顯子插入是突變對多數(shù)EGFR-TKI治療耐藥，但是除外以下特例：p.A763_Y764insFQEA 和p. A763_Y764insLQEA 。 對診斷性活檢或手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因檢測，其突變結(jié)果可作為ⅡB-ⅢA 期或高危ⅠB-ⅡA 期NSCLC患者的輔助靶向治療的重要依據(jù)。 T790M 是第一代和第二代EGFR-TKI主要的耐藥機(jī)制，通常情況下對于第三代EGFR-TKI治療有效。如果在之前沒有接受過EGFR-TKI治療的情況下出現(xiàn)T790M突變，則需要進(jìn)行遺傳咨詢和可能的種系基因檢測。 對于EGFR突變檢測目前常用的方法主要有PCR、Sanger測序和NGS。 ALK基因 02 間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphomakinase，ALK）基因融合在我國非小細(xì)胞肺癌中的發(fā)生率約5.6%，其中腺癌的發(fā)生率為6.6%-9.6%。伴有ALK基因融合的不可手術(shù)晚期NSCLC患者接受 ALK 抑制劑治療，ORR和PFS 顯著優(yōu)于含鉑化療，并改善患者的生活質(zhì)量。但是，ALK 基因融合陰性患者并不能從 ALK 抑制劑治療中獲益。建議所有經(jīng)病理學(xué)診斷為肺浸潤性腺癌（包括含腺癌成分）患者均需進(jìn)行ALK基因融合檢測。 EML4?ALK融合變體亞型目前發(fā)現(xiàn)有20余種，其中，最常見的是EML4的變體1［v1：外顯子13 與ALK 的外顯子20 融合（E13；A20）］和變體3v3a/b［外顯子6a/b與ALK 的外顯子20 融合（E6a/b；A20）］，這兩種變體類型約占總體的 60%。此外，該有TFG、KLC1、SOCS5、H1P1、TPR、BIRC6等基因融合。 目前，ALK常用的檢測方法有Ventana?D5F3 IHC、FISH、RT?PCR、NGS用于ALK 基因融合檢測，判讀標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒說明書。非Ventana D5F3抗體IHC檢測僅用于初篩。 ALK Ventana?D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經(jīng)濟(jì)的方法，且二元結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)簡單。但在臨床實踐中要警惕 ALK Ventana IHC 結(jié)果判讀中存在的一些陷阱，避免假陽性或假陰性（如富含黏液分泌的肺癌病例）。對于結(jié)果不能確定的患者，建議使用其他技術(shù)平臺進(jìn)行復(fù)檢。 FISH檢測ALK基因易位是經(jīng)典的檢測方法。但由于EML4?ALK易位是倒置易位，有些病例熒光分離信號距離較近，且斷裂點附近不穩(wěn)定，會產(chǎn)生染色體崩塌導(dǎo)致距離更近，加上立體空間位置，可造成假陰性判讀結(jié)果。對于 FISH信號不典型病例，應(yīng)推薦其他技術(shù)平臺進(jìn)行復(fù)檢。 ALK Ventana?D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經(jīng)濟(jì)的方法，且二元結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)簡單。但在臨床實踐中要警惕 ALK Ventana IHC 結(jié)果判讀中存在的一些陷阱，避免假陽性或假陰性（如富含黏液分泌的肺癌病例）。對于結(jié)果不能確定的患者，建議使用其他技術(shù)平臺進(jìn)行復(fù)檢。 FISH檢測ALK基因易位是經(jīng)典的檢測方法。但由于EML4?ALK易位是倒置易位，有些病例熒光分離信號距離較近，且斷裂點附近不穩(wěn)定，會產(chǎn)生染色體崩塌導(dǎo)致距離更近，加上立體空間位置，可造成假陰性判讀結(jié)果。對于 FISH信號不典型病例，應(yīng)推薦其他技術(shù)平臺進(jìn)行復(fù)檢。 對于ALK基因檢測的標(biāo)本選擇：優(yōu)先使用腫瘤組織標(biāo)本。腫瘤組織標(biāo)本不滿足要求時，推薦使用細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。對于少數(shù)客觀條件上不能獲得組織或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的晚期肺癌患者，可嘗試血液/腦脊液檢測。（如果手術(shù)樣本保存時間過長（3年以上）、未經(jīng)過規(guī)范化前處理的標(biāo)本可影響檢測結(jié)果。） 代表藥物：一代 克唑替尼（Crizotinib）、二代 阿來替尼（Alectinib）、塞瑞替尼（Ceritinib）、Brigatinib 、恩沙替尼 ；三代 Lorlatinib。 ROS-1基因 03 ROS-1基因作為肺癌驅(qū)動基因，其活化要是基因重排所致，常見的融合伴侶包括：CD74、SLC34A2、CCDC6 和 FIG。ROS-1和ALK二者氨基酸序列上具有近49%的相似性，在激酶催化區(qū)的ATP結(jié)合位點同源性高達(dá) 77％。ROS-1融合基因在非小細(xì)胞肺癌中的陽性率為1%-3.4%。 關(guān)于ROS-1融合基因檢測，國際多中心臨床研常用FISH或者PCR的方法。常規(guī)ROS-1免疫組化可作為初篩方法，但陽性標(biāo)本須以官方認(rèn)定批準(zhǔn)的PCR的方法 技術(shù)或者臨床研究使用的FISH方法進(jìn)一步確診。FISH方法可能檢測不出 FIG-ROS1變異。NGS方法可以檢測 ROS1 融合，但基于DNA的 NGS可能無法檢出 ROS1 融合。 代表藥物：克唑替尼 RET基因 04 RET原癌基因位于第10 號染色體長臂（10q11.21），編碼一種具有酪氨酸激酶活性的單次跨膜糖蛋白受體，作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞外信號分子，該類分子隸屬神經(jīng)營養(yǎng)因子家族。RET激酶受體可通過細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基的自磷酸化激活，觸 發(fā)包括RAS?MARK、PI3K?AKT、JAK?STA、PLCγ等與細(xì)胞增殖及存活相關(guān)的信號通路。 RET激活主要包括兩種改變形式：RET 基因點突變及RET 基因融合。RET 基因點突變常發(fā)生于甲狀腺髓樣癌（MTC），最常見的突變位點是 M918T。RET基因融合變異常見于甲狀腺乳頭狀癌（PTC）、NSCLC，亦可見于結(jié)直腸癌、唾液腺癌、卵巢癌等其他多種癌種中。 RET基因融合在NSCLC中發(fā)生率僅為1.4%-2.5%，最常見的斷裂位點位于第 11 號內(nèi)含子，部分融合斷點位于第 11 號外顯子和第 10 號內(nèi)含子，至今已發(fā)現(xiàn)至少 50 余種 RET 融合變體。我國內(nèi)多中心研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中KIF5B?RET為最常見的 RET 融合亞型，約占所有 RET 融合的68.3%，其最常見斷裂 位 點為 K15∶R12 及 K16∶R12；其次為 CCDC6?RET（16.8%，常見斷 C1∶R12）及 NCOA4?RET（1.2%）。對于未接受過靶向治療的人群，RET 融合通常與 EGFR、ALK、ROS1、BRAF 和 METex14跳躍等驅(qū)動基因變異相排斥。 目前常見的分子病理檢測方法包括免疫組織化學(xué)（IHC）、熒光原位雜交（FISH）、即時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT?PCR）、二代測序技術(shù)等。 IHC檢測RET融合其靈敏度50%-100%，特異度 30%-90%，綜合評價靈敏度和 特異度，IHC不是作為RET診斷的最佳手段，此外，通過IHC檢測確定RET表達(dá)量指導(dǎo)臨床靶向治療療效也存在偏差。目前暫不推薦直接用IHC檢測RET基因融合表達(dá)。 FISH 檢測經(jīng)典RET融合（KIF5B?RET，CCDC6?RET）的靈敏度最高，分別為100%和95%，其他非經(jīng)典融合如NCOA4?RET靈敏度僅為 66.7%。在 NGS或 RTPCR 不可及的情況下使用FISH進(jìn)行檢測，或樣本量較少或質(zhì)量不佳時，首選 FISH 檢測。 NGS根據(jù)檢測基因分子的類型不同分為基于DNA水平和RNA水平進(jìn)行檢測RET基因融合。DNA水平檢測到部分罕見融合斷裂位點可能并不能代表 RNA 水平的融合位點，在極少數(shù)情況下，DNA 水平上檢測到的基因易位并不會引起融合基因的表達(dá)。在進(jìn)行融合檢測時，基于 RNA 的NGS 優(yōu)于基于 DNA 的NGS。 代表藥物：普拉替尼（pralsetinib）、 塞爾帕替尼（selpercatinib） MET-14基因 05 間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子（MET）基因位于7號染色體（7q31.2）的長臂上，由MET基因編碼的蛋白為c-MET，也稱肝細(xì)胞生長因子受體，屬于酪氨酸激酶受體超家族。NSCLC中的MET基因發(fā)生異常激活，主要有３種形式：MET-14外顯子（MET ex14）跳躍突變、MET基因擴(kuò)增和蛋白過表達(dá)。 MET ex14跳躍突變在NSCLC中占3％-4％ ，在肺肉瘤樣癌（PSC）中占較高的比例（4.9%-31.8%），并且在女性和不吸煙者中發(fā)生率較高。MET ex14跳躍突變與KRAS、EGFR、ALK和RET等基因變異互斥。 目前用于檢測MET ex14跳躍突變的方法包括DNA NGS、外顯子14及其兩側(cè)內(nèi)含子的Sanger測序、反轉(zhuǎn)錄PCR和基于RNA的NGS檢測等。IHC不是檢測 MET ex14 跳躍的方法。 代表藥物：克唑替尼、卡博替尼、沃利替尼、Tepotinib、Capmatinib KRAS 06 KRAS基因是腫瘤中最常見的突變基因之一, 在我國肺癌患者中KRAS基因突變率約為8%-10%，其主要突變位點在第2號外顯子的第12和13密碼子，包括 G12C、G12V、G12D、G12F、G12R、G12A、G12S、G13C、G13D 等導(dǎo)致氨基酸替換的突變亞型，以KRAS-G12C最為常見。KRAS 通過下游的 RAF?MEK?ERK、PI3K?AKT?mTOR、Ral?GEFs等信號通路，參與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡、血管新生等生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 在肺癌中，KRAS 基因往往與其他基因突變共存 ，最常見的共存基因包括 TP53、STK11等。 KRAS-G12C突變多與重度吸煙有關(guān)，女性的發(fā)病年齡比男性更小、吸煙程度更輕，提示對煙草致癌物的易感性可能更高。。KRAS-G12C突變的患者更易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。 KRAS-G12C突變代表藥物：AMG 510、MRTX849。 BRAF 07 BRAF基因突變主要位于CR3激酶結(jié)構(gòu)域的第11外顯子及第15外顯子，其中BRAF最常見突變形式為第15外顯子的第1,799位核苷酸上T突變?yōu)锳，導(dǎo)致其編碼的纈氨酸變?yōu)楣劝彼?，即V600E。V600E突變是NSCLC常見的BRAF突變類型，多見于女性、腺癌患者，與預(yù)后的關(guān)系尚不十分明確。 PCR、Sanger測序和 NGS 是檢查 BRAF 突變狀態(tài)的最常用方法。 BRAF-V600E代表藥物：維羅非尼、達(dá)拉非尼。 NTRK 08 NTRK（NeuroTrophin Receptor Kinase）全稱神經(jīng)營養(yǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶，包含NTRK1、NTRK2 和 NTRK3，分別編碼原肌球蛋白受體激酶（TRK）家族TRKA、TRKB 和 TRKC 三種蛋白。在健康組織中，NTRK通路參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能以及細(xì)胞存活，在健康組織中起重要的作用。 NTRK基因家族（NTRK1、NTRK2和NTRK3），任何一個基因如果和其他的基因發(fā)生了融合突變，那么就會導(dǎo)致癌細(xì)胞異?；钚?，驅(qū)動腫瘤的發(fā)生。但NTRK基因融合并不常見，在中國肺癌患者中，NTRK突變小于5%。 目前用于檢測NTRK基因融合技術(shù)包括FISH、IHC、NGS和PCR檢測，其中，NGS二代測序最具優(yōu)勢，但是基于DNA的NGS 可能不能檢出NTRK1和NTRK3 融合。 代表藥物：拉羅替尼、恩曲替尼 加入“腫瘤醫(yī)生同行互幫互助群”系列，查詢下載所需的腫瘤資料及指南，同全國廣大腫瘤醫(yī)生同行免費學(xué)習(xí)交流。
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