在PLA技術(shù)中，不同類型的抗體上，連接有不同的核酸適體（1），另外二條寡核苷酸探針（2），各自都能與二個(gè)不同的核酸適體互補(bǔ)配對(duì)，在連接酶的作用下，二條寡核苷酸探針產(chǎn)生連接，因此再通過PCR擴(kuò)增，沒有讀出DNA序列的要求，只是通過滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生“多連體”，再有熒光標(biāo)記的單鏈核苷酸（3）與新合成的DNA序列配對(duì)，引入熒光標(biāo)記，并且結(jié)合點(diǎn)眾多，放大了靶點(diǎn)得熒光信號(hào)。不需要序列信息，只要有PCR擴(kuò)增超長(zhǎng)長(zhǎng)度的產(chǎn)物就行。

   換句話說，有無(wú)蛋白質(zhì)相互作用，就看有無(wú)DNA連接反應(yīng)發(fā)生。

二條寡核苷酸探針（2），各自都能與二個(gè)不同的核酸適體互補(bǔ)配對(duì)

DNA連接，之后是DNA復(fù)制（PCR反應(yīng)）

通過滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生“多連體”

 

熒光標(biāo)記的單鏈核苷酸（3）與新合成的DNA序列配對(duì)

大量的熒光標(biāo)記雜交在一個(gè)靶點(diǎn)上

    wedecided to monitor and quantify the Dnmt1/PCNA interaction byproximity ligation in situ assay (P-LISA) in cells . Asillustrated by the Figure 1A,the principle of this assay is based on the staining ofDnmt1 and PCNA proteins by two antibodies, which are nextrevealed by secondary antibodies conjugated witholigonucleotides. In presence of hybridization solutionand ligase, the two oligonucleotides form with PLA a circle in caseof close proximity of proteins i.e. Dnmt1 and PCNA, here. Then,polymerase and nucleotides participate to the formation of therolling circle amplification, which are visualized in redfluorescence.

A

 

 B

Figure 1. Detection ofendogenous Dnmt1/PCNA interactions using P-LISA.

(A) Schematic representation of the Dnmt1/PCNA proximityligation in situ assay (P-LISA).

(B) Calibration of the microscopy (Axiovert 200 M Zeiss, LePecq, France) with ApoTome module. Left: picture of calibrationperformed with calibration balls (4 μm, Vue X-Y,Molecular Probes F36909). Right: picture of calibration performedwith calibration balls (2.5 μm, Vue X-Z, MolecularProbes F36909). Blue and red were merged in lateral and axial.

(C) Decovolving of picture realized with calibration balls (140nm).

(D) Dnmt1/PCNA interactions were visualized in MCF10A cells.Red dots symbolize Dnmt1/PCNA interactions.Nucleus/DNA are stained in blue via the use ofDAPI. Top left: ApoTome view, top right: orthogonal view,bottom: 3D views.

引自：Proximity ligation insitu assay for monitoring the global DNA methylation incells.BMCBiotechnology

 

PLA is an antibody-based method in which either a single or twoproteins (or antigens) are immunolabeled first with two primaryantibodies and then with different species-specific secondaryantibodies conjugated to complementary oligonucleotides (8,9).When two antibody molecules are in close proximity, thecomplementary DNA strands can be ligated, amplified, and visualizedwith a fluorescent probe as distinct puncta (Figure 1). Each spotmay represent a single complex containing each of two interactingproteins (or antigens). The maximal distance between thesecondary antibodies in this assay is ~16 nm, onlyslightly larger than that for resonance energy transfer betweenfluorophores (~10 nm), the most common approach used to infer GPCRoligomerization. By measuring close proximity, PLA allows avalidation in vivo of the molecular proximity of two endogenousproteins, something that cannot be established with simplecolocalization studies, thereby making it possible to interrogatethe existence and localization of interactions in vivo.

Figure 2. The Duolink assayprinciple. (A) Two primary antibodies raised in differentspecies are used to detect two target antigens of interest [here asexamples, gray/green (left) against a target protein (green), andlight gray/yellow (right) against a second target protein(yellow)]. (B) Each species-specific secondary antibody (dark grayand light gray, respectively) provided in the Duolink kit has aunique short DNA strand attached to it (black line). When thesecondary antibodies are in close proximity, the DNA strands caninteract through a subsequent addition of two other circle-formingDNA oligonucleotides (circular black line). The distance betweenthe two secondary antibodies is a maximum of 16 nm as calculatedfrom the number of nucleotides in the attached DNA arms. (C) Afterenzymatic ligation, the two added oligonucleotides are amplifiedvia rolling circle amplification using a polymerase to yield a longconcatemeric copy of the circle formed by ligation. (D) After theamplification reaction, labeled complementary oligonucleotideprobes are added to highlight the product (redcircles).  

引自：Detection of antigen interactions ex vivo by proximityligation assay: endogenous dopamine D2-adenosine A2A receptorcomplexes in the striatum.BioTechniques.2011.PierreTrifilieff^{1,2, 3}, Marie-LaureRives^{3,4, 5, 6}, EnekoUrizar*^{4,5, 6}, Rebecca A.Piskorowski¹, Harshad D.Vishwasrao¹, JohnCastrillon³, ClaudiaSchmauss^2,5, MariaSl?ttman⁷, MatsGullberg⁷, and Jonathan A.Javitch^{4,5, 6, 8}

 

轉(zhuǎn)帖：

蛋白質(zhì)檢測(cè)新技術(shù)——鄰位連接技術(shù)及初步應(yīng)用

唐  娜¹ 沈志強(qiáng)^1，2 管  宇¹ 王金良¹

(1山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濱州256600)

(2山東綠都生物科技有限公司 濱州256600)

 

   鄰位連接技術(shù)是近幾年建立的一種可以用于研究蛋白質(zhì)的定量、定位、相互作用、修飾以及功能的新DNA連接技術(shù)。該技術(shù)通過一對(duì)鄰位探針將特異性蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)換為DNA序列分析，可以直接分析復(fù)雜的生物樣品，檢測(cè)靈敏度和精確度高。本文總結(jié)了國(guó)外相關(guān)報(bào)道，對(duì)PLA技術(shù)原理，PLA技術(shù)的種類進(jìn)行了系統(tǒng)的介紹，并介紹了該方法在生物標(biāo)記因子檢測(cè)、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)一DNA相互作用以及疾病診斷中的初步應(yīng)用。

1  PLA技術(shù)原理

1．1 PLA技術(shù)原理

   DNA連接技術(shù)早在20世紀(jì)70年代首次發(fā)現(xiàn)連接酶之后便被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)分析中，最早用于研究tRNA的分子作用機(jī)制。此后陸續(xù)出現(xiàn)了多種新的連接技術(shù)，如用于單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(singlenucleotide polymorphisms，SNPs)的寡核苷酸連接分析(oligonucleotide ligationassay，OLA)技術(shù)，以及用于基因組和蛋白質(zhì)組分析的Padlock探針技術(shù)，這種寡核苷酸可以和特定的核酸序列反應(yīng)環(huán)化而進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircle replication，RCA)，而PLA便是應(yīng)用一種類似機(jī)制的探針講行蛋白后檢測(cè)的技術(shù)。

   PLA技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)的核心是一對(duì)鄰位探針。該對(duì)探針將單鏈DNA與一對(duì)蛋白識(shí)別因子相連接，使其可以通過免疫吸附或其他方法同步結(jié)合到一個(gè)待測(cè)蛋白分子上。PLA反應(yīng)分為3步：1)樣品與帶有靶特異性抗體的一對(duì)鄰位探針共孵育，2條鄰位探針雙雙與靶相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合；2)加入連接試劑和PCR擴(kuò)增試劑，在連接酶作用下使得同一目的蛋白上的鄰位探針對(duì)DNA尾部的游離5’端和3’端與互補(bǔ)序列雜交并發(fā)生鄰位連接反應(yīng)，形成一個(gè)環(huán)狀的蛋白質(zhì)一蛋白識(shí)別分子_單鏈DNA復(fù)合物。3)采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增復(fù)合物中的單鏈DNA部分。只有在一對(duì)探針均與目標(biāo)蛋白結(jié)合，且相互間距離足夠貼近時(shí)，鄰位連接反應(yīng)才能夠發(fā)生，因此PLA的非特異性檢測(cè)極少，這一優(yōu)點(diǎn)使得PLA與常規(guī)PCR或RCA方法相比，具有更高的特異性和檢測(cè)靈敏度。

1．2鄰位探針

   鄰位探針由蛋白結(jié)合部分和可連接的單鏈DNA寡核苷酸部分組成。最早報(bào)道的鄰位探針，其蛋白結(jié)合部分是一類單鏈DNA"配基”(適體，aptamer)，經(jīng)由SELEX技術(shù)(SystematicEvolution 0f Ligands bv ExponentialEnrichment，指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))從隨機(jī)核酸庫(kù)中選擇產(chǎn)生，能夠高特異性、高親和力地識(shí)別目的分子。不過，運(yùn)用SELEX程序篩選出可用于鄰位連接的配基數(shù)量十分有限，這在一定程度上限制了核酸配基探針的應(yīng)用。

   近來，人們開始研究運(yùn)用單克隆抗體建立鄰位探針對(duì)，利用化學(xué)交聯(lián)劑或者生物素一鏈親和素將低聚核苷酸與抗體蛋白共價(jià)連接，形成抗體_單鏈DNA復(fù)合探針，從而大大擴(kuò)大了PLA技術(shù)的檢測(cè)范圍。Gullberg等分別采用化學(xué)法和生物法將DNA單鏈與抗體結(jié)合制備出抗體一DNA單鏈復(fù)合物。

   化學(xué)法是利用雙功能交聯(lián)試劑SMPB(4-[p—maleimidophenyl]butyrate)將抗體與巰基修飾的DNA單鏈交聯(lián)。

   生物法則是利用鏈親和素(streptavidin)與生物素(biotin)之間的高親和力，先將鏈親和素與巰基修飾的DNA單鏈結(jié)合形成鏈親和素_單鏈DNA復(fù)合物，經(jīng)純化除去游離的鏈親和素及單鏈DNA；鏈親和素．單鏈DNA復(fù)合物再直接與生物素修飾的抗體在室溫下結(jié)合，便可形成終產(chǎn)物抗體一單鏈DNA復(fù)合探針。應(yīng)用鏈親和素生物素法時(shí)，只需改變抗體種類便可以用于檢測(cè)多種蛋白質(zhì)分子，其適用范圍更為廣泛。

   合成探針可以用單克隆抗體、多克隆抗體甚或抗體重組片段，但很多情況下多克隆抗體更適合PLA技術(shù)。因?yàn)閯?dòng)物的多克隆血清可以識(shí)別目標(biāo)蛋白的多個(gè)抗原表位，這有利于一對(duì)鄰位連接探針識(shí)別同一目標(biāo)蛋白，從而使探針的DNA末端更為接近。此外，對(duì)于發(fā)生輕微變性的目標(biāo)蛋白，多抗的識(shí)別能力比單抗強(qiáng)一些。

   探針與蛋白結(jié)合位點(diǎn)的親和力是一項(xiàng)十分重要的因素，Gustafsdottir應(yīng)用多種鄰位探針檢測(cè)IL-2、IL4、VEGF、PDGF等細(xì)胞因子時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果將鄰位探針的檢測(cè)靈敏度提高10倍，則PLA的檢測(cè)限可以降低100倍?？贵w復(fù)合物的質(zhì)量也可以顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制備出的鄰位探針中游離DNA單鏈和抗體的含量較高可以影響檢測(cè)信號(hào)，增大背景干擾，因此探針的純化很重要。Gullberg等設(shè)計(jì)了一套簡(jiǎn)單實(shí)用的兩步純化方法，先用飽和硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)去除游離的DNA單鏈，再用乙醇沉淀除去游離的鏈親和素。由該方法純化的鏈親和素-DNA復(fù)合物經(jīng)芯片電泳定量分析，平均每個(gè)鏈親和素分子上可以結(jié)合一個(gè)DNA分子，而殘留的游離DNA的量低于10％。

目前PLA探針的制備正逐步走向商業(yè)化，如OLINK生物科技公司生產(chǎn)的DuolinkTM試劑盒，該試劑盒包括DNA標(biāo)記的二抗(即PLA探針)、檢測(cè)試劑、以及對(duì)照試劑等。用戶可以根據(jù)試驗(yàn)所需抗體種屬購(gòu)買相應(yīng)的二抗探針試劑盒，直接用于PLA檢測(cè)。

2  多種PLA技術(shù)

2．1單相PLA(homogeneous PLA)

   常規(guī)PLA反應(yīng)是在單一介質(zhì)中進(jìn)行的，該技術(shù)可以將待檢測(cè)樣品、鄰位探針、熒光PCR引物以及其他連接與放大試劑加入同一管中進(jìn)行連接反應(yīng)與熒光定量PCR，操作步驟簡(jiǎn)單，用時(shí)短，上樣量少，適用于微量蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)。

2．2固相PLA

   PLA反應(yīng)可以在固定表面上進(jìn)行：待測(cè)蛋白或病原樣品首先與固定于微孔板壁的蛋白(如：抗體)結(jié)合，樣品中的其他未結(jié)合分子可以通過洗滌去除；再加入鄰位探針進(jìn)行連接，洗滌去除未結(jié)合探針，最后加入連接和放大試劑，通過實(shí)時(shí)定量PCR放大信號(hào)并檢測(cè)。這項(xiàng)技術(shù)可以用于檢測(cè)含量過低的蛋白，而且運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)可以通過洗滌去除樣品中能夠抑制連接和擴(kuò)增的成分，也可以去除游離的PLA探針，從而提高檢測(cè)靈敏度。Gustafsdottir等將單相PLA、固相PLA、與ELISA三種方法進(jìn)行了比較，用此三種方法檢測(cè)PDGF—BB蛋白，固相PLA的檢測(cè)限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ELISA，甚至比單相PLA更低一些。

2．3原位PLA

   Soderberg等利用滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification，RCA)技術(shù)的局部性特點(diǎn)，建立了一種全新的、可對(duì)相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)定位的PLA方法，即原位PLA(proximityligation in sireassay)，簡(jiǎn)稱P-LISA．在P-LISA方法中，鄰位探針并非同時(shí)結(jié)合到同一個(gè)蛋白質(zhì)分子上，而是與待測(cè)的2個(gè)具有相互作用的蛋白質(zhì)分子分別結(jié)合。當(dāng)這2個(gè)蛋白質(zhì)分子因?yàn)橄嗷プ饔枚拷鼤r(shí)，鄰位連接探針也因此相互靠近，此時(shí)，反應(yīng)體系中加入的DNA短序列與探針上的DNA鏈互補(bǔ)，在連接酶的作用下形成環(huán)狀DNA。以此環(huán)狀DNA為模板，以其中1個(gè)探針上的DNA鏈作擴(kuò)增引物，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。RCA反應(yīng)1h即可以形成1條含有約1000個(gè)重復(fù)環(huán)狀DNA序列的DNA單鏈。若DNA短序列帶有熒光標(biāo)記，則可以直接觀測(cè)到相互作用的兩個(gè)蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞中的定位。由于環(huán)狀DNA模板的成環(huán)反應(yīng)不受鄰位連接探針個(gè)數(shù)的影響，P-LISA法可進(jìn)一步應(yīng)用于3個(gè)，甚至更多具有相互作用的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位。

2．4多元PLA

   Fredriksson等運(yùn)用相應(yīng)的單抗或多抗設(shè)計(jì)出4組6元和7元探針，采用多元PLA技術(shù)進(jìn)行胰腺癌和卵巢癌血漿生物標(biāo)記分子的初步研究，將多種蛋白質(zhì)分析轉(zhuǎn)換成單一的DNA擴(kuò)增檢測(cè)，每次僅需lul樣品便可以檢測(cè)多個(gè)血漿生物標(biāo)記分子，如整合素和金屬蛋白酶8，CA-125，CAl9-9，羧肽酶A1，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、上皮細(xì)胞粘附分子、胰島素樣生長(zhǎng)因子2、白介素7、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子等等。結(jié)果表明基于多種特異性抗體的多元PLA技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于探索和驗(yàn)證多種疾病的生物標(biāo)記分子。

2．5 3PLA

   Schallmeiner等開發(fā)出一種新的多功能PLA技術(shù)，該技術(shù)命名為3PLA：在常規(guī)PLA基礎(chǔ)上，將第1、2探針DNA連接末端用一段核苷酸序列封閉，以避免連接前發(fā)生非特異性結(jié)合；新增加一個(gè)第3探針，只有在3個(gè)探針同時(shí)結(jié)合到目的蛋白上時(shí)，1、2探針的末端封閉序列才能在第3探針連接端的競(jìng)爭(zhēng)連接下脫落；與第3探針結(jié)合的l、2探針與一段盒式核苷酸(cassetteoligonucleotide)連接形成新序列，用于qPCR擴(kuò)增(圖3)。3PLA采用3種識(shí)別機(jī)制，更好地避免了非特異性結(jié)合，具有極高的特異性和靈敏度，可以從含有抑制劑的復(fù)雜樣品中檢測(cè)出含量低至100個(gè)分子的血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肌鈣蛋白I和PSA。

3 PLA技術(shù)的應(yīng)用

3．1用于生物標(biāo)記因子的檢測(cè)

   PLA技術(shù)最早即用于細(xì)胞因子的檢測(cè)，近幾年在檢測(cè)生物標(biāo)記因子方面的應(yīng)用發(fā)展尤為迅速。Yang等應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選出一對(duì)核苷酸配基探針，分別針對(duì)凝血酶蛋白的兩個(gè)不同表位，且3’端互補(bǔ)。熒光PCR結(jié)果表明，應(yīng)用該對(duì)探針檢測(cè)凝血酶，聚合酶反應(yīng)初速度與樣品中凝血酶的濃度在一定范圍內(nèi)(10pmol／L～1nmol/L)呈線性正相關(guān)(R。=0．996)，檢測(cè)限達(dá)6．9pmol/fL，檢測(cè)靈敏度高。Kristiansdottir等以生物素鏈親和素法將抗SPl(轉(zhuǎn)移因子特異性蛋白1)單抗和單鏈DNA偶聯(lián)制備鄰位探針，檢測(cè)干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)。Zhu等運(yùn)用PLA技術(shù)檢測(cè)前列腺癌的標(biāo)記因子前列腺特異性抗原(PSA)，可以有效地檢測(cè)PSA單體及復(fù)合體，且與PSA前體或相似度極高的激肽釋放酶hK2不發(fā)生交叉反應(yīng)，從而提高檢測(cè)靈敏度到0．07ug／L，約是其他常用方法的十分之一。

3．2用于蛋白質(zhì)問相互作用研究

   多數(shù)蛋白質(zhì)的生物活性需要通過二次修飾或與其他蛋白反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，而蛋白質(zhì)復(fù)合物功能的發(fā)揮需要其所有組成蛋白共同參與，因此，開發(fā)一種用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的檢測(cè)技術(shù)相當(dāng)重要。Jarvius等采用P-LISA檢測(cè)經(jīng)過血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(PDGF—BB)刺激后細(xì)胞的血小板衍生生長(zhǎng)因子受體B(PDGFRp)磷酸化的程度。首先分別選擇抗鼠、抗兔免疫球蛋白(一抗)的抗體(二抗)與DNA單鏈偶聯(lián)制備成二抗探針。細(xì)胞的PDGFRB分子受到PDGF—BB刺激后形成二聚體并發(fā)生磷酸化，分別以抗磷酸化rryr一751殘基的鼠源一抗和抗PDGFRB的兔源一抗與之結(jié)合，則同一PDGFRp分子二聚體上會(huì)有兩種一抗緊密相鄰，加入二抗探針后，每對(duì)探針的DNA單鏈緊密相鄰，在連接酶作用下可利用帶有熒光標(biāo)記的DNA短序列形成環(huán)狀DNA分子；而未受刺激的PDGFR~分子不發(fā)生磷酸化，則只能結(jié)合兔源一抗，從而不能繼續(xù)反應(yīng)，通過熒光顯微鏡觀察不到熒光。

   Gustafsdottir等運(yùn)用PLA分析血管上皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factorA，VEGF~)與其兩種受體VEGFR-1和VEGFR~的作用，檢測(cè)結(jié)果與受體磷酸化分析結(jié)果一致，而檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，時(shí)間僅需3小時(shí)，并且可以建立劑量響應(yīng)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算蛋白間親和能力(半數(shù)最高抑制濃度，IC50)。

3．3用于蛋白--DNA相互作用研究

   Gustafsdottir等根據(jù)PLA技術(shù)原理，建立了一種新的體外檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確靈敏地分析細(xì)胞核內(nèi)蛋白和核酸的相互作用，彌補(bǔ)凝膠阻滯分析(electrophoreticmobility shiftassay，EMSA)等方法的不足。他們首先設(shè)計(jì)了一對(duì)不同的PLA親和探針：一條是以多抗或單抗為識(shí)別分子的PLA探針，另一條則一端為雙鏈DNA的DNA核酸配基。探針的抗體或雙鏈DNA端可以分別特異性地識(shí)別待測(cè)的DNA結(jié)合蛋白(或者兩個(gè)相互作用的蛋白質(zhì)與DNA分子)相關(guān)位點(diǎn)，另一端則可以和連接互補(bǔ)序列雜交。一旦這對(duì)特異性探針同時(shí)結(jié)合到DNA結(jié)合蛋白上，探針的游離端便在連接酶的作用下形成一段序列特異性模板，通過實(shí)時(shí)熒光PCR即可分析待測(cè)DNA結(jié)合蛋白與雙鏈DNA之間的相互作用。應(yīng)用此技術(shù)檢測(cè)人類疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子p53，HNF4c~，USFl，結(jié)果證明該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊設(shè)備，對(duì)試劑與樣品的消耗量小，檢測(cè)靈敏度極高，可以精確到1～10個(gè)細(xì)胞，且檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好，與EMSA方法以及模體預(yù)測(cè)軟件得出的結(jié)論一致。因此，可將該方法用于深人分析DNA結(jié)合蛋白的序列特異性和評(píng)估轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性效應(yīng)。

3．4用于疾病診斷研究

   目前傳染性疾病診斷的主要手段之一是檢測(cè)微生物病原蛋白和病原核酸。但由于感染時(shí)產(chǎn)生的蛋白抗原的種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于病原核酸，檢測(cè)病原蛋白將比檢測(cè)病原核酸更靈敏、更重要。然而，目前雖然有一些可以監(jiān)測(cè)進(jìn)行性感染的蛋白質(zhì)診斷方法，但其檢測(cè)靈敏度相對(duì)很低。而PLA技術(shù)可以非常靈敏地檢測(cè)復(fù)雜生物樣品中的蛋白質(zhì)，監(jiān)測(cè)細(xì)菌和病毒相關(guān)蛋白，檢測(cè)靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快速。

   Gustafsdottir等建立了檢測(cè)勞森氏胞內(nèi)菌(Lawsonia intracellularis)和豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus)的固相PLA和液相PLA方法，并與ELISA法和定量PCR法進(jìn)行比較，結(jié)果證明：PLA法可以直接檢測(cè)復(fù)雜生物樣品(如胎兒組織、糞便)而無(wú)需前處理，檢測(cè)靈敏度能比常規(guī)檢測(cè)方法提高3～4個(gè)數(shù)量級(jí)。液相PLA可以一步法檢測(cè)樣品，無(wú)需洗滌或分離，樣品量?jī)H需要lul，而常規(guī)ELISA法檢測(cè)的樣品量至少是其1000倍；固相PLA方法可以極其靈敏地分析復(fù)雜組分樣品中的微生物病原量，由于低濃度特異性抗體的加入，大大降低了探針的非特異性結(jié)合，且加入的過量連接序列也使得探針的未結(jié)合末端被“封閉”，最終PLA檢測(cè)的非特異性范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于定量PCR方法，甚至可以精確到1個(gè)或幾個(gè)病原微生物。田間試驗(yàn)表明PLA方法檢測(cè)結(jié)果與ELISA法及HA法的結(jié)果有良好的相關(guān)性。

   Pai等根據(jù)細(xì)菌芽孢表面蛋白性質(zhì)，合成多價(jià)短肽-DNA-藻紅蛋白復(fù)合物作為PLA探針“burr”，通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)細(xì)菌芽孢可以精確檢測(cè)到100個(gè)炭疽桿菌、10個(gè)枯草芽孢桿菌、1個(gè)蠟狀芽孢桿菌的芽孢。Nordengrahn等應(yīng)用此方法進(jìn)行口蹄疫病毒(FMDV)野毒感染的診斷，結(jié)果表明，該P(yáng)LA方法可以區(qū)別診斷7種FMDV血清型，檢測(cè)病毒的靈敏度很高，是抗原捕獲ELISA方法的100余倍；該方法可以檢測(cè)到5TCID50的病毒，其靈敏度與實(shí)時(shí)RT-PCR相近。

   總之，PLA技術(shù)作為一項(xiàng)新的蛋白質(zhì)分析工具，具有很高的特異性和靈敏度，可以用于炎癥、腫瘤疾病等病理生理過程研究，甚至可用于細(xì)胞表面蛋白功能狀態(tài)的觀察，以及病毒和細(xì)菌等感染因子的檢測(cè)，在基礎(chǔ)研究和疾病診斷等研究領(lǐng)域中具有重大意義。

   中國(guó)生物工程雜志2009.8

 

鄰位連接技術(shù)PLA在蛋白-蛋白相互作用，蛋白磷酸化修飾的應(yīng)用

  

摘要　鄰位連接技術(shù)（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ＰＬＡ），是新研發(fā)的一項(xiàng)高靈敏度的蛋白質(zhì)體外分析技術(shù)。該方法利用一對(duì)鄰位探針（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙｐｒｏｂｅｓ）對(duì)靶分子進(jìn)行雙識(shí)別，通過連接反應(yīng)產(chǎn)生可擴(kuò)增的檢測(cè)信號(hào)，以實(shí)時(shí)ＰＣＲ進(jìn)行放大和檢測(cè)，將對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)變成為對(duì)ＤＮＡ的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)痕量蛋白的分析，具有極高的檢測(cè)靈敏度和特異性。綜述了鄰位連接技術(shù)的原理、研究進(jìn)展以及該技術(shù)在蛋白質(zhì)分析及疾病診斷領(lǐng)域的初步應(yīng)用。
關(guān)鍵詞　鄰位連接技術(shù)　鄰位探針　蛋白質(zhì)分析　疾病診斷
中圖分類號(hào)?。眩担?br>收稿日期：２００９０２１０　　修回日期：２００９０４１３
 通訊作者，電子信箱：ｂｚｓｈｅｎｚｑ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
　　

鄰位連接技術(shù)是近幾年建立的一種可以用于研究蛋白質(zhì)的定量、定位、相互作用、修飾以及功能的新
ＤＮＡ連接技術(shù)。該技術(shù)通過一對(duì)鄰位探針將特異性蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)換為ＤＮＡ序列分析，可以直接分析復(fù)雜的生物樣品，檢測(cè)靈敏度和精確度高。本文總結(jié)了國(guó)外相關(guān)報(bào)道，對(duì)ＰＬＡ技術(shù)原理，ＰＬＡ技術(shù)的種類進(jìn)行了系統(tǒng)的介紹，并介紹了該方法在生物標(biāo)記因子檢測(cè)、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-ＤＮＡ相互作用以及疾病診斷中的初步應(yīng)用。
１　ＰＬＡ技術(shù)原理
１．１?。校蹋良夹g(shù)原理
　　ＤＮＡ連接技術(shù)早在２０世紀(jì)７０年代首次發(fā)現(xiàn)連接酶之后便被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)分析中，最早用于研究ｔＲＮＡ的分子作用機(jī)制。此后陸續(xù)出現(xiàn)了多種新的連接技術(shù)，如用于單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳＮＰｓ）的寡核苷酸連接分析
（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ＯＬＡ）技術(shù)，以及用于基因組和蛋白質(zhì)組分析的Ｐａｄｌｏｃｋ探針技術(shù)，這種寡核苷酸可以和特定的核酸序列反應(yīng)環(huán)化而進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（ｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ），而ＰＬＡ便是應(yīng)用一種類似機(jī)制的探針進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)的技術(shù)。
　?。校蹋良夹g(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)的核心是一對(duì)鄰位探針。該對(duì)探針將單鏈ＤＮＡ與一對(duì)蛋白識(shí)別因子相連接，使其可以通過免疫吸附或其他方法同步結(jié)合到一個(gè)待測(cè)蛋白分子上。ＰＬＡ反應(yīng)分為３步：１）樣品與帶有靶特異性抗體的一對(duì)鄰位探針共孵育，２條鄰位探針雙雙與靶相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合；２）加入連接試劑和ＰＣＲ擴(kuò)增試劑，在連接酶作用下使得同一目的蛋白上的鄰位探針對(duì)ＤＮＡ尾部的游離５′端和３′端與互補(bǔ)序列雜交并發(fā)生鄰位連接反應(yīng)，形成一個(gè)環(huán)狀的蛋白質(zhì)?蛋白識(shí)別分子?單鏈ＤＮＡ復(fù)合物。３）采用實(shí)時(shí)定量熒光ＰＣＲ擴(kuò)增復(fù)合物中的單鏈ＤＮＡ部分。只有在一對(duì)探針均與目標(biāo)蛋白結(jié)合，且相互間距離足夠貼近時(shí)，鄰位連接反應(yīng)才能夠發(fā)生，因此ＰＬＡ的非特異性檢測(cè)極少，這一優(yōu)點(diǎn)使得ＰＬＡ與常規(guī)ＰＣＲ或ＲＣＡ方法相比，具有更高的特異性和檢測(cè)靈敏度。

 

 

 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào) > 2008年4期

鄰位連接技術(shù):一種新的高靈敏度蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)誕生以來,高效準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)受到越來越多的關(guān)注,最近,一種高靈敏度的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù),鄰位連接技術(shù)(proximtyligationassay,PLA)被建立.該技術(shù)采用核酸適體(aptamer)或單/多克隆抗體.核酸復(fù)合物作為鄰位連接探針(proximityprobes).當(dāng)一對(duì)鄰位探針同時(shí)識(shí)別同一個(gè)目標(biāo)蛋白分子時(shí),它們將在空間位置上相互臨近,通過連接反應(yīng)形成一段可擴(kuò)增的DNA標(biāo)簽序列,該標(biāo)簽序列能夠反映待測(cè)蛋白的種類及濃度.該技術(shù)將對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)DNA核酸序列的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了特殊蛋白質(zhì)的檢測(cè),定量及定位.文章從該方法的產(chǎn)生背景,發(fā)展過程,原理以及探針制備等方面對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的介紹,列舉了該方法的幾種重要應(yīng)用,并對(duì)該方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望.