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好久不見，大家好！今天跟大家掰扯掰扯EMSA

當最初看文獻遇到這個實驗時，迎面而來的各種探針和十幾條泳道讓我有些懵逼，吭哧吭哧大體明白了實驗，但是對一些細節(jié)還是不太清楚

近日看了一個視頻徹底明白了這個實驗原理，趁著還是熱乎的，分享給大家。此外很遺憾因為咱不做實驗，所以這篇推送不涉及高端實驗技巧騷操作

EMSA初體驗

凝膠遷移實驗（Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)）是常用的功能分析實驗，主要用于研究結合蛋白與DNA/RNA結合序列相互作用，可用于定量和定性分析。

先來看一看我主要的幾個大兄弟

• 細胞粗提取液或者純化蛋白

• 標記（labeled）探針，待研究序列

  

       看到沒

• 競爭性探針，用于競爭性實驗檢驗蛋白是不是與標記探針特異性結合，需要過量加入，使勁懟就是了

  

• （冷）特異性競爭探針 Specific Competitor DNA，可標記探針競爭性結合蛋白



• （冷）非特異性競爭探針 Non-specific Competitor DNA，可非特異性地結合蛋白，就是與蛋白結合很弱，有時候也叫突變競爭性探針



你問為啥它們cold呢......因為沒有標記（unlabeled）罩著可不就冷嗎？

原理簡單說

就是一句話，與蛋白質結合的核酸探針在凝膠中移動速度更慢（遷移率低），未結合的探針移動的快。

如圖，同位素標記（label）的探針與純蛋白或細胞提取液孵育后，在凝膠中加樣電泳（加樣孔在上方），與蛋白質結合的探針移動的慢（上方條帶），未結合的探針移動的快（下方條帶）。

隨著加入的蛋白質不斷增加，結合有蛋白的探針越來越多，自由的探針越來越少（上方條帶也來越來越深，下方條帶越來越淺）。

super shift

當想知道細胞提取液中與DNA結合的蛋白時，會先用一些生信工具預測可能與該區(qū)域結合的蛋白質，然后合成該蛋白質的抗體，再將抗體加入EMSA實驗中產生一條新的super shift條帶，因為若該抗體與相應蛋白質結合以后分子量更大，移動更為滯后。

如圖，加入另一種蛋白后，之前的條帶變淺，產生一條新的滯后條帶

這里需要注意的是，這種滯后的原因可能是新蛋白與原先的蛋白結合，也可能是結合到探針的另一個位置上，所以嚴謹的話需要加一步，單獨加入探針和新蛋白，看看它們是不是也會結合。

PS. 如果想能夠看出條帶，是需要加同位素標記的，上圖沒有顯示應該是疏忽。

整體來康康～

• 泳道1：input DNA（也就是標記探針），全都移動到最下面，顯示出較粗的條帶

• 泳道2：加入標記探針和蛋白質，一部分標記探針與蛋白質結合遷移滯后，產生了兩個條帶

• 泳道3：加入過量的特異性競爭探針擠占了蛋白質上的結合位點，雖然也遷移滯后，但是因為沒有標記，所以不會顯現

• 泳道4：非特異性探針即使過量，也不能爭奪標記探針與蛋白質結合，因而顯現標記探針與蛋白質結合的條帶，證明了標記探針與蛋白質結合的特異性

• 泳道5：加入蛋白質的抗體，產生super shift，確定與標記探針特異性結合的蛋白質身份

再給個栗子

比如：研究某區(qū)域SNP[A/G]對于該區(qū)域與轉錄因子結合強弱的影響。

會先合成該SNP所在區(qū)域幾十bp的標記探針(2種)和非標記探針（2種）(用于競爭性實驗)

-----A------*       -----G------*

-----A------          -----G------

然后提取某種細胞的粗提取液，設計上述類似實驗，研究哪個allele結合轉錄因子的能力更強，是否是特異性結合。

eg.

Abolishment of an Oct-1 binding site in the CHRNA3 promoterby the rs6495309T>C change. A,electrophoretic mobility-shift assay with biotin-labeled rs6495309T or rs6495309C probes and H1299 nuclear extract.Lanes 1 and 6, probe only; lanes 2 and 7, probe and nuclear extracts;lanes 3 to 5 and 8 to 10, probe and nuclear extracts plus 100× unlabeled rs6495309T (lanes 3 and 8), rs6495309C (lanes 4 and 9), or Oct-1 consensusprobes (lanes 5 and 10).B, electrophoretic mobility-shift assay with antibody. Lanes 4 and 9,with antibody to Oct-1;lanes 5 and 10, with rabbit IgG

碎碎念時間

很多實驗原理并不難，但是一些概念解釋不清，或者說不夠生動，很影響理解，比如EMSA中的cold probe，冷競爭實驗等。EMSA很常用，也有一些該實驗中文介紹，可能該說的也說的，但是我不做實驗，就不容易串起來，對小白不太友好。

另一方面，如果我們在接觸新事物時先搞清楚概念和背景，串起來理解，它就不那么玄乎了和高大上了，對后面的學習也更有幫助，反之，亦然。

參考資料

• EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) Fig 5.36

  https://www.youtube.com/watch?v=G7VZfFM5YM8

• Wu C, Hu Z, Yu D, et al. Genetic variants on chromosome 15q25 associated with lung cancer risk in Chinese populations. Cancer Res. 2009;69(12):5065–5072. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-0081