背景
在當(dāng)今眾多的癌癥治療手段中，免疫療法無疑是近年來最為吸引人們眼球的“明星”治療手段，普遍引起學(xué)術(shù)界及醫(yī)學(xué)界的強烈關(guān)注和研究興趣。
隨著以T細胞受體T細胞技術(shù)（TCR-T）、嵌合抗原受體T細胞技術(shù)（CAR-T）以及免疫檢查點阻斷技術(shù)（Immune Checkpoint Blockade）為代表的新興腫瘤免疫療法不斷取得臨床上的突破和成功，奇跡頻現(xiàn)，捷報頻傳，持續(xù)更新著人們對機體免疫系統(tǒng)潛在的強大腫瘤殺傷能力的認(rèn)知，進一步提高人們戰(zhàn)勝惡性腫瘤的信心，當(dāng)然也持續(xù)激發(fā)著科研人員對“腫瘤免疫療法”這一強大抗癌利器的研究和開發(fā)熱情。
而對于腫瘤免疫療法的研究，離不開相關(guān)動物模型的選擇和建立。事實上，目前已經(jīng)取得臨床成功的腫瘤免疫療法中，無一例外都已經(jīng)過大量嚴(yán)格的臨床前動物實驗進行驗證、評估和預(yù)測?？梢?，相關(guān)動物模型的建立對于腫瘤免疫療法的開發(fā)和應(yīng)用是至關(guān)重要且必不可少的。
免疫療法相關(guān)腫瘤模型
一、以CAR-T/TCR-T為代表的細胞過繼性療法（Adoptive Transfer）常用腫瘤動物模型
細胞過繼性療法是指將供體（donor）細胞（此處主要是T淋巴細胞）經(jīng)體外刺激活化或者基因修飾后再次回輸入受者（Recipient）體內(nèi)，從而達到相關(guān)治療目的的治療方式。
供體細胞可以是來源于受者自身，也可以來自于其他個體，前者稱為自體移植（Autograft），后者則有兩種情況，如果受者與供者屬于相同種屬，稱為同種異體移植（Allograft），反之則為異種移植（Heterograft）。
CAR-T/TCR-T技術(shù)的主要技術(shù)路線是分離、擴增、純化病人自身T淋巴細胞，經(jīng)體外基因修飾使之表達具有腫瘤抗原/腫瘤相關(guān)抗原識別及結(jié)合能力的、人為改造的CAR或TCR分子，隨后再將修飾后的T細胞回輸入腫瘤患者體內(nèi)，以喚醒和激發(fā)患者自身免疫系統(tǒng)，殺傷和清除體內(nèi)腫瘤細胞。從這一層面來說，CAR-T/TCR-T療法屬于自體移植過程。
然而，相應(yīng)的動物模型往往是將人源的修飾T細胞輸入至接種有人源腫瘤細胞或腫瘤組織的成瘤小鼠體內(nèi)，進而模擬人體內(nèi)的治療過程，此時，這一治療方式則屬于異體移植。
眾所周知，異體移植的首要問題便是免疫排斥作用，為此，要將人源的腫瘤細胞、腫瘤組織以及修飾后的人源T細胞成功接種于小鼠，就必須使用高度免疫缺陷的實驗小鼠。
目前用于CAR-T/TCR-T療法動物模型的免疫缺陷小鼠比較單一，主要是非肥胖糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷（Non-Obese Oiabetic ,Severe combined immunodeficiency, NOD/scid，基因型為NOD.CB17-Prkdcscid）小鼠以及NSG （NOD scid gamma，基因型為NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）小鼠。
NOD/scid和NSG小鼠都具有T細胞、B細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）聯(lián)合發(fā)育缺陷的特性，并且NSG小鼠表現(xiàn)為更強烈的T、B細胞功能缺陷，因而相較于NOD/scid小鼠，其應(yīng)用范圍較廣。
用于建立模型的人源腫瘤細胞株則因研究目的及腫瘤類型不同而各不相同，但主要是高表達相應(yīng)腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的細胞系或細胞株。
NOD/scid和NSG腫瘤模型具備優(yōu)點：
①遺傳背景明確；
②成瘤率高、腫瘤生長穩(wěn)定；
③體內(nèi)干擾因素少、適用腫瘤范圍廣以及模擬程度較高
缺點：但也存在著價格貴、成本高、培育時間長的不足，對于大規(guī)模使用局限性較大。
舉例：下面，我們將以靶向CD19的CAR-T細胞治療模型為例。
主要操作過程：
實驗小鼠：NSG聯(lián)合免疫缺陷小鼠
細胞株：外周血原代細胞制備的CD19特異性CAR-T細胞；人源B淋巴細胞瘤細胞系Nalm6細胞（高表達CD19），實驗前一般需要將Nalm6細胞過表達熒光素酶報告基因（Luc-Nalm6），以便于后續(xù)的腫瘤細胞體內(nèi)成像示蹤。
注：常用于模型建立的高表達CD19的人源細胞系還有Daudi細胞和Raji細胞系，均屬于B淋巴瘤細胞系；若是要建立NK細胞的體內(nèi)腫瘤殺傷模型，一般選擇K562細胞株建模。
操作步驟：
①制備原代CD19特異性CAR-T細胞；
②選取6-10周齡大小NSG小鼠，做好分組；
③制備Luc-Nalm6細胞PBS單細胞懸液，調(diào)整濃度為1×107cells/ml；
④每只NSG小鼠經(jīng)尾靜脈注射1×106 Luc-Nalm6細胞（100μl上述單細胞懸液）；
⑤腫瘤細胞注射7天后開始進行CAR-T細胞尾靜脈注射，每次注射量約為5-10×106細胞。根據(jù)具體情況，可一次性注射，也可分批次2-3天注射一次；
⑥CAR-T細胞注射治療一周后，將實驗小鼠麻醉，進行IVIS體內(nèi)成像觀察、檢測；根據(jù)腫瘤細胞存活情況進行后續(xù)的治療處理。
圖1. CAR-T/TCR-T療法腫瘤模型構(gòu)建模式圖
圖2. CAR-T療法腫瘤模型IVIS體內(nèi)成像效果，可見CAR-T細胞灌注后，腫瘤細胞熒光顯著降低（參考文獻1）
以上為血液瘤CAR-T治療動物模型的建立及檢測的主要操作過程，該法同樣適用于CIK（Cytokine-Induced killer cell）、LAK（Lymphokine Activated killer cell）、腫瘤DC疫苗等其它過繼性細胞療法動物模型的建立。
對于其它腫瘤尤其是實體瘤，一般采取皮下、原位注射相應(yīng)細胞系或直接移植腫瘤組織的建模方式；當(dāng)然，考慮到建模成本、樣本容量以及某些細胞株的易成瘤特性，也可采用胸腺發(fā)育缺陷的裸小鼠（T淋巴細胞缺陷）進行腫瘤建模，但一般均會對裸小鼠進行環(huán)磷酰胺注射的免疫抑制預(yù)處理，以提高建模和移植的成功率，具體操作方法需視研究目的及情況而定。
二、以PD-1/PD-L1、CTLA4為代表的免疫檢查點阻斷療法常用腫瘤動物模型
與CAR-T/TCR-T等細胞過繼療法不同，免疫檢查點阻斷療法的核心是釋放免疫系統(tǒng)的“剎車”限制，即解除免疫系統(tǒng)的抑制及對腫瘤細胞的免疫耐受狀態(tài)，重新激發(fā)免疫效應(yīng)細胞對腫瘤細胞的殺傷能力進而達到抗擊腫瘤的效果。
因此，免疫檢查點阻斷療法是依賴于機體自身的免疫細胞的，其動物模型的建立也往往采用具備正常免疫功能的小鼠（Immune competent mouse），將之進行同品系腫瘤細胞系移植，建立的是同系腫瘤小鼠模型（Syngeneic tumor model）。
同系腫瘤小鼠模型建立方法較為一致，重點是選擇與實驗小鼠品系相同的腫瘤細胞系。舉例：筆者所在課題組進行的是基于C57BL/6小鼠背景的腫瘤相關(guān)功能基因研究，所采用的正是C57BL/6品系來源的黑色素瘤細胞系B16F10細胞以及路易斯肺癌細胞系LLC細胞。
主要操作過程為：
①皮下或原位注射相關(guān)細胞系；
②待腫瘤組織生長到一定程度，進行PD-1/PD-L1、CTLA4等免疫檢查點治療性單克隆抗體或相關(guān)化合物的體內(nèi)給藥處理；
③隨后對腫瘤生長狀況進行測量跟蹤；
④大多數(shù)情況下，往往還要對給藥后的成瘤小鼠進行外周淋巴器官及腫瘤組織內(nèi)淋巴細胞的分離純化；
⑤針對浸潤免疫細胞的激活及殺傷功能進行系列檢測，以最終評價相關(guān)藥物對于免疫系統(tǒng)的激活情況及腫瘤治療效果。
圖3. 同系腫瘤小鼠模型（Syngeneic tumor model）的建立
同系腫瘤小鼠模型本質(zhì)上屬于同種異體移植，具有自身的優(yōu)勢和特點。
優(yōu)點：
①具備完整的免疫功能，適用于靶向免疫系統(tǒng)的抗腫瘤研究；
②宿主排斥性小，能正常模擬腫瘤在體內(nèi)的生長及發(fā)展過程；
③成本低，重復(fù)性好；
④適用腫瘤范圍廣；
⑤可操作性好，并且易于達到符合統(tǒng)計學(xué)要求的樣本量。
缺點：同系腫瘤小鼠模型也會存在一些局限性，主要是腫瘤細胞為鼠源性，其表達的免疫檢查點分子與人類的同源蛋白分子相比會有一定的差異，反映的藥效對于人類腫瘤的治療移植性也存在一定的偏差；另外，該模型中的腫瘤組織往往生長過快，不利于模擬自發(fā)腫瘤的生長情況。
盡管如此，同系腫瘤小鼠模型仍然是目前基于免疫檢查點阻斷的腫瘤免疫療法研究領(lǐng)域備受青睞和廣泛使用的研究模型，適用于大部分基于改善機體免疫狀況及腫瘤微環(huán)境的腫瘤免疫療法研究，未來必將得到進一步的優(yōu)化和改進，在腫瘤免疫療法相關(guān)藥物篩選和評價中發(fā)揮重要作用。
圖4. 同系腫瘤小鼠模型（Syngeneic tumor model）常用細胞系及其品系
總結(jié)
腫瘤免疫療法是近年來嶄現(xiàn)抗癌新希望的治療手段，每一項新療法的出現(xiàn)及臨床應(yīng)用都離不開大量的臨床前動物實驗數(shù)據(jù)的支撐。
鑒于腫瘤免疫療法是一新興的研究領(lǐng)域，其在大部分實體瘤的治療方面局限性還比較大，尚有大量的研究工作需要開展和探究，相應(yīng)的動物模型也因而必不可少。
目前，應(yīng)用于腫瘤免疫療法研究的動物模型主要還集中在基于重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（過繼性細胞回輸）以及同系腫瘤細胞系小鼠模型（免疫檢查點阻斷）的研究，未來隨著基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫療法領(lǐng)域的應(yīng)用，以及多種治療手段與免疫療法組合的聯(lián)合治療方式的出現(xiàn)，對相關(guān)動物模型的建立和優(yōu)化也提出了更高的要求，未來腫瘤免疫療法相關(guān)動物模型也必將經(jīng)歷一系列的開發(fā)和優(yōu)化過程。
參考文獻
1、Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition Clin Cancer Res. 2016 Nov 4. pii: clincanres.1300.2016. [Epub ahead of print]
2、Pre-Clinical Murine Models: Syngeneic Models for Immuno-Oncology. 2015；http://medcraveonline.com/MOJI/MOJI-02-00052.pdf
3、The importance of animal models in tumor immunity and immunotherapy Curr Opin Genet Dev. 2014 Feb;24:46-51. doi: 10.1016/j.gde.2013.11.008. Epub 2013 Dec 29.
4、Animal models of tumor immunity, immunotherapy and cancer vaccines. Curr Opin Immunol. 2004 Apr;16(2):143-50.
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