1. ChIRP-Seq（Chromatin Isolation by RNA Purification）

ChIRP-Seq：培養(yǎng)的細(xì)胞在活細(xì)胞中交聯(lián)，它們的染色質(zhì)被提取并均勻化。利用磁性鏈霉親和素珠，將感興趣的RNA與目標(biāo)RNA雜交并分離得到生物素化互補(bǔ)寡核苷酸。將純化的染色質(zhì)洗脫成蛋白質(zhì)、RNA或DNA，然后進(jìn)行下游檢測(cè)以進(jìn)行鑒定和定量，ChIRP-Seq能在全基因組水平上對(duì)lncRNA與染色質(zhì)之間所有潛在的相互作用位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。

原理：戊二醛固定細(xì)胞后，利用聲波降解法進(jìn)行細(xì)胞裂解和染色質(zhì)斷裂，在裂解物中加入帶生物素標(biāo)記的oligo探針與lncRNA雜交，利用鏈霉素親和磁珠分離純化（與生物素親和）。最后加RNaseA，從復(fù)合物中將lncRNA結(jié)合的蛋白和DNA片段洗脫下來(lái)，用于后續(xù)分析。

實(shí)驗(yàn)操作視頻鏈接：https://www.jove.com/video/3912/chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

實(shí)驗(yàn)操作protocol：

二、RNA原位雜交（RNA in situ hybridization）

RNA原位雜交（RNA in situ hybridization）：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對(duì)原則，與待測(cè)細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相雜交，經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA/lncRNA等分子，可檢測(cè)該lncRNA是否位于核內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

原理：將特定標(biāo)記的已知序列核酸做為探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。根據(jù)RNA序列設(shè)計(jì)cDNA探針，可結(jié)合RNA和DNA。

三、熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)

FISH：對(duì)于RNA分布定位，一般會(huì)使用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）。該技術(shù)利用熒光探針，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則, 在細(xì)胞或組織內(nèi)與靶l(wèi)ncRNA雜交，再利用激光共聚焦顯微鏡等檢測(cè)手段，通過(guò)熒光分布及強(qiáng)度判斷l(xiāng)ncRNA分子分布狀態(tài)。驗(yàn)證其亞細(xì)胞定位，從而推測(cè)lncRNA的調(diào)控機(jī)制。

原理：用已知的標(biāo)記單鏈為探針，與材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雙鏈核酸。將核酸探針的某種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子，如地高辛，生物素?？衫迷搱?bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異性親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)過(guò)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA或RNA進(jìn)行定性，定量或相對(duì)定位分析。

實(shí)驗(yàn)操作視頻鏈接

https://www.jove.com/video/3328/in-situ-hybridization-for-precise-localization-transcripts

實(shí)驗(yàn)操作protocol：

四、RACE（rapid amplification of cDNA ends）

RACE：基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA，通過(guò)往兩端延伸而獲得完整的3’和5’端的方法。該方法可確定lnc RNA5’和3’末端序列，進(jìn)而獲得lncRNA的全長(zhǎng)序列

3’原理：利用RNA3’端PolyA尾做為引物結(jié)合點(diǎn)，利用Oligo(dt)作為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后以一個(gè)基因特意引物GSP1作為上游引物，用一個(gè)通用引物UPM做下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，吧目的基因3’端的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)。

5’原理：利用Oligo（dt）結(jié)合3’端PolyA反轉(zhuǎn)出第一鏈cDNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶的活性在第一鏈的5’端加上3-5個(gè)（dc）殘基，退火后與Oligo（dg）通用引物，一第一鏈為模板延伸并接上通用接頭。然后用通用引物UPM為上游，特意基因引物GSP2為下游以第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，把目的基因5’端cDNA片段擴(kuò)增出來(lái)。

Self-ligation原理：用5’端磷酸化RT Primer反轉(zhuǎn)錄，用RNA酶將RNA分解，用RNA ligase進(jìn)行環(huán)化或形成首尾連接物，PCR擴(kuò)增5’端未知區(qū)域，膠回收后DNA序列測(cè)定。

五、Northern blot

Northern blot：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)RNA的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)。

原理：根據(jù)分子量大小不同將不同的RNA分離開來(lái)，將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物上，再用標(biāo)記過(guò)的DNA或RNA為探針，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行顯影或顯色。以目標(biāo)RNA所在位置，顯影強(qiáng)度可指示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量。

六、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（檢測(cè)miRNA對(duì)mRNA表達(dá)）

熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)：在熒光素酶報(bào)告基因載體的報(bào)告基因編碼區(qū)下游插入lncRNA結(jié)合序列或者mRNA 3’UTR區(qū)，然后將載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況以分析lnc RNA或mRNA的3’UTR區(qū)中是否含有miRNA的靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)操作視頻鏈接

https://www.jove.com/video/3343/identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

實(shí)驗(yàn)操作protocol：

七、CLIP-Seq(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing）

CLIP-Seq：也稱為HITS-CLIP，是將紫外交聯(lián)免疫共沉淀技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，在全基因組水平上揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的技術(shù)。

原理：在紫外照射下將細(xì)胞內(nèi)RNA分子與RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，細(xì)胞裂解，通過(guò)免疫沉淀將RNA與蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀，核酸酶將共沉淀RNA切割，只保留蛋白質(zhì)內(nèi)部的RNA片段。通過(guò)5’端放射性標(biāo)記分子及SDS-PAGE電泳，選擇性回收蛋白結(jié)合的RNA片段，最后進(jìn)行高通量測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)操作視頻鏈接

https://www.jove.com/video/2638/iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

實(shí)驗(yàn)操作protocol：

八、RIP(RNA Immunoprecipitation)

RNA蛋白免疫沉促使細(xì)胞內(nèi)RNA，蛋白質(zhì)之間交聯(lián)，形成RNA-Protein復(fù)合物。之后用特異性抗體免疫沉淀復(fù)合物，與蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA即可被分離，純化。之后對(duì)分離的RNA進(jìn)行PT-PCR，RIP-Chip或高通量測(cè)序（RIP-Seq）分析。

九、EMSA(electrophoretic mobility shift assay)

凝膠遷移或電泳遷移實(shí)驗(yàn)，是一種研究DNA-蛋白質(zhì)或RNA-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。

原理：將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。RNA復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)的慢。該實(shí)驗(yàn)是將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。如果蛋白質(zhì)可以跟DNA或RNA結(jié)合，它的泳動(dòng)速度就會(huì)比非結(jié)合的DNA或RNA探針慢。

實(shí)驗(yàn)操作視頻鏈接

https://www.jove.com/video/54093/screening-for-functional-non-coding-genetic-variants-using

十、RNA Pulldown

使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò)WB或MS來(lái)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)操作視頻鏈接：https://www.jove.com/video/57786/biotin-based-pulldown-assay-to-validate-mrna-targets-cellular