通過一些生信分析手段選定了一個lncRNA/circRNA的時候要如何確定它的亞細胞定位，明確其分子功能呢？進行后續(xù)的基礎(chǔ)實驗研究呢？小薇今天就掰開來揉碎了跟大家好好說說。
讓大家在后續(xù)的實驗方案或者標(biāo)書技術(shù)路線方案設(shè)計中選擇最適合自己的解決辦法。
大家都熟知非編碼RNA的分子功能與其所在的亞細胞位置密切相關(guān)。比如，位于細胞核或染色體上的lncRNA常通過影響表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄過程來調(diào)控基因表達，也可以通過直接與靶基因結(jié)合來激活或抑制靶基因的表達。然而，細胞質(zhì)中的lncRNA則更可能參與翻譯調(diào)控或通過吸附miRNA來發(fā)揮ceRNA功能。特殊細胞器定位的組織特異性lncRNA則可參與細胞器的功能和代謝調(diào)控，如線粒體的氧化反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)平衡等。
一般來講，研究lncRNA亞細胞定位的方法有：熒光標(biāo)記探針進行熒光原位雜交（FISH）、分離胞漿和胞質(zhì)的RNA進行PCR檢測（核質(zhì)分離）。
1. FISH方法和結(jié)果解讀
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先來了解下什么是FISH
采用了已知序列的、特異性的單鏈核酸作為探針，標(biāo)記了生物素或熒光素，在一定的條件下通過堿基互補配對法則，使得DNA-DNA原位雜交，采用熒光法顯色，最終將DNA在細胞爬片、石蠟切片或者冰凍切片的原始位置上標(biāo)記出來的一種技術(shù)。用熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，更直觀。
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寫作要點
樣品固定和預(yù)處理，探針和樣品變性，雜交，洗脫，雜交信號的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針），封片、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果。當(dāng)然現(xiàn)在也有成熟的試劑盒，方法部分也可以簡化處理。
文獻示例1（影響因子=41.4，PMID: 31752906）
Hu et al. Molecular Cancer (2019) 18:167 ，https://doi.org/10.1186/s12943-019-1097-9
方法解析1
細胞樣本（NOZ和SGC-996細胞），固定（4%多聚甲醛），變性和雜交（蛋白酶試劑處理后，用預(yù)雜交緩沖液40°C孵育4 h，然后用地高辛標(biāo)記探針40°C雜交過夜。）雜交信號擴大（用SABC-FITC在37°C孵育30分鐘）。共聚焦顯微鏡觀察。
結(jié)果解析1
DAPI藍色熒光代表細胞核，F(xiàn)ITC綠色熒光探針代表lncRNA，merge后明顯可以看到該lncRNA分布在細胞質(zhì)中。
文獻示例2（影響因子=23.168，PMID: 35526050）
方法解析2
本文方法描述比較簡單，直接說明FISH試劑盒（廠家，產(chǎn)地），說明按照試劑盒的操作說明進行實驗的。本文作者還設(shè)置了陽性對照探針U6和18S（細胞核和細胞質(zhì)組分），這點還是比較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹?/p> 結(jié)果解析2
DAPI 細胞核(藍色), lncROPM (紅色), 18S 細胞質(zhì)(紅色), U6 細胞核(紅色)。結(jié)果顯示，lncROPM主要位于細胞質(zhì)中。
2. 核質(zhì)分離方法和結(jié)果解讀
核膜有內(nèi)核膜和外核膜兩層，差不多各8nm左右，比胞膜韌，用低滲處理的時候，胞里邊多的是液狀的胞質(zhì)，胞質(zhì)膨脹所以破膜，在未破膜之前，胞漿比核內(nèi)滲透高，所以核還是處于一個高滲的狀態(tài)，破膜之后，核處于低滲狀態(tài)，但由于不同的滲透耐性，核膜不會破。
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寫作要點總結(jié)
細胞系，細胞處理劑及時間（視具體實驗而定），細胞質(zhì)提取液成分，細胞核提取液成分，離心的條件。核質(zhì)分離基本都是用試劑盒來提取分離，所以也可以簡化。
文獻示例1（影響因子=23.168，PMID: 35526050）
方法解析1
本文采用的就是簡化處理辦法，直接說明試劑盒，然后qRT-PCR檢測相對表達。也設(shè)置了U6作為核內(nèi)參，GAPDH作為細胞質(zhì)內(nèi)參。對于核質(zhì)分離實驗來說qRT-PCR檢測中的核質(zhì)內(nèi)參還是要交代清楚的，這點很有必要。
結(jié)果解析1
qRT-PCR柱狀圖展示lncROPM主要在細胞質(zhì)中表達。與FISH結(jié)果一致，更具說服力。
文獻示例2（影響因子=6.832，PMID: 35212607）
方法解析2
本文方法部分比上一篇稍微詳細了點，可以看到離心速度和時間。但試劑盒基本沒啥問題，按照說明書方法來寫就可以的。
結(jié)果解析2
核質(zhì)分離的qRT-PCR檢測結(jié)果顯示lncRNA PEG10主要定位于細胞質(zhì)中。
總結(jié)
FISH與核質(zhì)分離實驗有相同的功能，都可以觀察lncRNA的亞細胞定位，即lncRNA定位于胞漿還是胞核；FISH的圖片應(yīng)標(biāo)注清楚每個圖片中熒光所表示的分子，分組情況也要表明圖注中應(yīng)該包含細胞系的名稱和處理方法，每種顏色的所代表的分子，這里標(biāo)注的方式比較特別，直接在圖上用不同的顏色來輸入分子名稱，用以代表熒光顏色，如紅色、綠色、藍色書寫lncROPM，F(xiàn)ITC和DAPI名稱表示紅色、綠色、藍色熒光分別代表這三種分子；也可以直接在圖注中寫出來，如“Fluorescent staining: DAPI (blue), lncROPM (red), 18S (red), U6 (red)”。熒光圖的放大倍數(shù)應(yīng)該直接標(biāo)注出來，或者也可以是在方法部分給出。例如文獻2中圖注描述 (Original magnifcation,×200, Scale bar, 50 μm)。
關(guān)于非編碼RNA細胞定位的方法和結(jié)果解讀，今天就分享到這里了，希望對你有用。關(guān)注小薇，科研道路上我們相互結(jié)伴，共同進步！
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