芯片的概念及發(fā)展歷史 D NA 芯片 （又稱基因芯片、生物芯片） 技術是自 20 世紀 90 年代初發(fā)展起來的新興 技術， 是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針， 有規(guī)律地排列固定于支持物上， 然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交， 再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)或 CCD 成像掃描系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比 較和檢測，從而迅速得出所要的信息。順應上述發(fā)展要求的產物，它的出現(xiàn)為解決此類問題 提供了光輝的前景。該技術系利用芯片制造技術，將大量 （通常每平方厘米點陣密度高于 400） 探針分子固定于支持物上，再與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的 雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。 它可以對生命科學與醫(yī)學中的各種生物 化學反應過程進行集成，從而實現(xiàn)對基因、配體、抗原等生物活性物質進行高效快捷的測試 和分析。它的出現(xiàn)將給生命科學、醫(yī)學、化學、新藥開發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭、司法鑒定、食品 與環(huán)境監(jiān)督等眾多領域帶來巨大的革新甚至革命。
20 世紀 80 年代，Ba i ns 等人就曾將短的 D NA 片斷固定到支持物上，借助雜交方式 進行序列測定。 DNA 芯片從實驗室走向產業(yè)化卻是直接得益于探針固相原位合成技術和 但 照相平板印刷技術的有機結合以及激光共聚焦顯微技術的引入， 它使得合成、 固定高密度的 數(shù)以萬計的探針分子切實可行，而且借助激光共聚焦顯微掃描技術可以對雜交信號進行實 時、 靈敏、 準確的檢測和分析。 1996 年， f yme t r i x 公司成功研制出首批實用 DNA 芯 Af 片和芯片閱讀器，為 DNA 芯片產業(yè)開創(chuàng)了先河。DN A 芯片技術由于同時將大量探針固定 干支持物上， 所以可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析， 從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜 交 （ Sou t he rnb l o t t i ng 和 No r t he r n b l o t t ing 等） 技術操作復雜、自動化程度低、 操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方 法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因 組文庫作圖及雜交測序等。
根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類：
原位合成芯片（synthetic gene chip）
采用顯微光蝕刻等技術在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片。這種芯片的集成度教高，可達10萬～40萬點陣/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長度較短，一般為8～20個核苷酸殘基（nucleotide，nt），最長為50nt，因此需要使用多個相互重疊的探針片進行檢測，才能對基因進行準確的鑒定。
DNA微集芯片（DNA microchips）
將預先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為DNA微集芯片，又稱為DNA微集陳列（DNA microarray）。這類芯片集成度相對較低，可達1萬～10萬點陣/平方厘米，但使用的探針組的來源比較靈活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用來自基因組的較長的DNA片段；可以是雙鏈，也可以采用單鏈的DNA或RNA片段，且技術實現(xiàn)未受到嚴格的專利控制，因而近年來發(fā)展很快。探針的長度可達100～500nt。
一、芯片的制備
芯片制備的基本原理。
芯片的制備包括支持物的預處理、原位合成芯片的準備和DNA微集陳列的制備三個方面。
1.支持物的預處理
目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實性材料和膜性材料。實性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實性材料需要進行預處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的光敏保護基團形成共價交聯(lián)而被保護起來，合成時在光照下除去光敏保護基團，該活性基團又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學反應。另一方面，這些活性基團可與DNA分子中的羥基等基團形成共價結合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷吸附帶負電荷的DNA探針。
2.原位合成芯片的制備
原位合成芯片是采用顯微光蝕刻（photolithography）技術或壓電打?。╬iezoelectric printing）技術，在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技術也稱為光引導聚合技術（light-directed synthesis），它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技術（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸，多肽固相合成技術相結合的產物，是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機相似，所用的技術也是常規(guī)的固相合成方法。
3.DNA微集陳列的制備
DNA微集陳列的制備采用的是預先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式。
二、樣品的準備
樣品的準備包括樣品的分離純化、擴增和標記等過程。
1．樣品的分離純化
主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA，這個過程包括細胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過程。
2．樣品的擴增
測定時往往需要較多的樣品分子，因此對于分離獲得的基因組DNA通過PCR技術直接擴增，對于mRNA則需要逆轉錄，制備cDNA。
3.樣品的標記
標記物主要有熒光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。帶有標記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通過DNA或cDNA擴增的過程，摻入靶分子序列。也可以在制備引物時，摻入標記的核苷酸，擴增靶序列后，使擴增產物末端帶有標記物。膜性載體可以用于檢測同位素標記的樣品。
樣品分子標記的質量影響芯片檢測的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉錄以及標記等各環(huán)節(jié)要求嚴格操作。熒光標記分辨率高于同位素標記，而且可以采用雙色，如對照樣品標紅色，待檢樣品標綠色，有助于結果分析與判斷。
三、分子雜交
芯片雜交是應用標記的待測樣品（靶序列）與固定在載體表面的探針進行的復雜過程。
依據(jù)探針長度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應時間。通常采用的條件是：42℃，50%甲酰胺，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt試劑。也可采用65℃，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt試劑或者65℃，10%SDS，7%PEG-800。
雜交過程類似Northern或Southern雜交，如封閉液預雜交、雜交、清洗、干燥與檢測。
四、檢測分析
芯片雜交信號的檢測可應用熒光檢測法、質譜法、化學發(fā)光法、光導纖維法以及生物傳感器法。其中激光共聚焦熒光檢測法是最常應用的方法：激光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用面，與探針雜交的靶序列標記物被激發(fā)產生熒光，經(jīng)過棱鏡聚焦而被檢測器檢測。樣品靶序列與探針嚴格配對雜交的分子發(fā)生強熒光信號，不完全雜交顯示較弱的信號。
核酸是由核苷酸(nucleotide) 按一定次序連接而成的生物有機高分子。堿基可以分為 5 種堿基，分別為腺嘌呤(adenine ，縮寫為 A) 、胸腺嘧啶 (thymine ，縮寫為 T) 、尿嘧啶 (uracil ，縮寫為 U) 、胞嘧啶 (cytosine ，縮寫為 C) 和鳥嘌呤(guanine ，縮寫為 G) 。兩 條核苷酸分子鏈能夠通過連續(xù)的堿基互補相結合， 而互補方式只能是 A 對 T、 A 對 U 或 C 對 G。最常提到的核酸分子是 DNA( 由 A、 T、 C 、 G 序列構成)和 RNA( 由 A 、 U、 C、 G 序列構成) ，其中 DNA 分子就是通過這種堿基互補方式形成其穩(wěn)定的雙鏈螺 旋結構。 DNA 分子鏈上的一些片段能夠以堿基互補的方式將其信息傳遞給 mRNA 分子 (稱為轉錄) ，然后通過 mRNA 合成出蛋白質(稱為翻譯) ，這些片段被稱為基因。如果兩 個核酸分子的堿基序列不互補，那么它們之間的配對結合(又稱為雜交)就不會發(fā)生。利用這 種高度的特異性，含有一個已知基因序列的核酸分子，可被視為一個分子探針 ， 該探針通 過和生物樣品中與之互補的目標核酸分子的雜交來檢測出相應的基因。
核酸芯片，又稱 DNA 芯片或基因芯片，就是把成千上萬個不同序列的核酸探針分子 以點陣的形式固定在芯片表面， 然后和經(jīng)過熒光標記的樣品進行雜交反應。 在雜交后的清洗 步驟中，沒有和探針結合上的核酸分子將被去除，而結合到探針上的目標核酸分子，其熒光 標記在特定波長激光激發(fā)下會發(fā)出熒光信號， 其信號強度表征了樣品中被檢測到的目標核酸 分子或基因的總量或濃度。 借助專門的熒光掃描設備得到的這樣一張各探針點亮度不相同的 雜交圖譜，經(jīng)過計算機軟件的處理，研究者可以一次獲得樣品中眾多基因的量化分析結果， 從而迅速地指導與基因有關的一系列研究。
DNA芯片使用的基本流程。
DNA芯片使用包括待測樣品準備、分子雜交和檢測分析3個步驟。
1.待測樣品的準備
樣品的準備包括樣品的分離純化、擴增和標記。
首先采用常規(guī)方法從組織細胞中分離純化樣品核酸、DNA或mRNA，由于目前芯片檢測儀器的靈敏度有限，要求對樣品中靶序列進行高效而特異地擴增。樣品的標記主要采用熒光法，也可以用生物素，放射性核素標記法。
2.分子雜交
待測樣品經(jīng)擴增和標記處理后，即可與DNA芯片上的探針陳列進行分子雜交。芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類似，屬固-液雜交。探針分子固定于芯片表面，與位于液相的靶分子進行反應。芯片雜交的特點是探針的量顯著大于靶基因片段，雜交動力學呈線形關系。雜交信號的強弱與樣品中靶基因的量成正相關。
3.檢測分析
芯片雜交及清洗后，未雜交分子被清除，帶有熒光標記的靶DNA（雜交分子）與其互補的DNA探針形成雜交體，在激光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光。以掃描儀對熒光信號進行檢測和分析，通過陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來。
DNA芯片技術在醫(yī)學領域的應用
DNA芯片用于基因診斷、DNA序列測定、臨床藥物篩選、法醫(yī)鑒定、 食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測等方面。在醫(yī)學領域具有極大的潛力。
1.基因診斷
應用DNA芯片技術可以在DNA水平檢測與疾病相關的內源性或外源性基因；應用表達芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的發(fā)育階段，正常及病理狀態(tài)基因表達的差異，也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀態(tài)下表達的差異，從而為疾病診斷與分類，病原微生物分型提供科學依據(jù)。
2.DNA序列測定
任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解成一系列堿基數(shù)固定、錯落而且重疊的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五個錯開1個堿基但是可重疊7個堿基的8體亞序列，當然也可以分解成7體，9體或其他整數(shù)（n體）亞序列。如果用某種方法將5個亞序列全部測定出來，就可以重新組建原來的核苷酸排列順序。應用這一原理，可以合成或應用已知序列的所有可能的n體寡核苷酸，并將其固定在芯片表面，然后與標記的待測靶序列雜交，經(jīng)過重新組合，即可得到待測的DNA序列。
3.臨床藥物篩選
臨床許多細菌對藥物具有抗藥性，但是不同的亞型對同一藥物的敏感性不同。DNA芯片技術已被用于鑒定結核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利福平的相關性以及HIV產生抗藥性與其逆轉錄酶及蛋白酶基因突變的相關性。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段。
4.其他領域
法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測等方面，DNA芯片技術也將具有極大的潛力。
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