如果選擇的方法不對，或者細胞株不對，不同的細胞株做基因敲除細胞系的改造會有什么變化呢？篩選細胞是基因敲除細胞成敗的重要環(huán)節(jié)！如果沒有正確的方法那么基因敲除的細胞株工作就不能順利的進行，首先要知道影響基因敲除細胞系的主要關(guān)鍵點是什么？其次是要了解和熟悉具體的實驗流程和實驗步驟，讓自己輕松的完成基因敲除細胞株的構(gòu)建流程。
一. 如何選擇基因敲除的細胞：
1.關(guān)鍵點：支原體污染在絕大部分的實驗室里都不太被重視，如果支原體污染了細胞，則會導致細胞產(chǎn)生很多問題：如細胞的增殖問題，同時還會影響細胞的代謝，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)也會有很大的誤差，所以在實驗室里的技術(shù)人員都需要非常重視。
2.檢測方法有兩種：細胞培養(yǎng)和PCR鑒定。
3.基因敲除的優(yōu)勢：克隆形成率高，敲除效率高，細胞容易增殖，但是有一個例外就算是做了細胞基因敲除株的構(gòu)建，也無法獲得基因敲除的單克隆細胞，那就是沒有多基因的問題；染色體不突變；難增殖的細胞；細胞的數(shù)量有限；做基因敲除細胞株難以得到純合子敲除的細胞系的原因就是克隆的拷貝數(shù)太多。
4具體原因：只能是腫瘤細胞系，不能是永生細胞系，往往很多永生細胞系做起來都比較有挑戰(zhàn)性，當在做基因敲除細胞株時，如果敲除效率是x，則拷貝數(shù)是n，那么純合敲除的效率就是：x^n，可見效果就不顯著了。
二. 基因敲除細胞系的敲除方法：
1.建議首選：如果只是做常規(guī)的移碼敲除，那么一個細胞里面只有2個基因位點，是很難保證兩個基因位點是一樣的移碼，所以得到移碼的數(shù)據(jù)也不同，當你在鑒定測序看圖的時候就沒有那么清晰，所以，選擇片段敲除是一個較為有效的辦法。
2.關(guān)鍵點：移碼敲除在很多時候并不徹底，會在后續(xù)的實驗中出現(xiàn)Western Blot的問題，出現(xiàn)神秘的條帶，大片段的基因敲除是幾kb的缺失，mRNA就沒有目的蛋白的轉(zhuǎn)錄，Western Blot問題也解決了，鑒定敲除方法：純合敲除細胞系，比移碼敲除效率更高。
3.如何判斷是大片段敲除的細胞系：主要是通過目的基因片段對PCR擴增的方式判斷。
三. 細胞周期分析：
1.如果采用病毒法，構(gòu)建載體，病毒包裝，轉(zhuǎn)染細胞，細胞篩選，單克隆，PCR鑒定/測序，擴增——一個步驟都不能少。
2.使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，構(gòu)建好敲除質(zhì)粒后，直接用質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到細胞。
3.做基因敲除細胞株時，不要選擇增殖太慢的，如果過表達量的Cas9蛋白+gRNA快速靶向，最快只需要5周時間，7-12周就可以得到純合子細胞。
四.細胞拿到怎樣用：
如果是單克隆的細胞需要大量擴增，完全不用擔心培養(yǎng)過程中蛋白恢復的問題，所有的細胞都必須經(jīng)過嚴格測試，保證安全無污染，低內(nèi)毒素可以直接用于動物體內(nèi)實驗，做代謝分析也能更加安心。如果移碼突變，大量擴增可能會出現(xiàn)恢復（特別是敲除的蛋白對細胞增殖有優(yōu)勢的情況）細胞動物實驗和代謝研究更放心。
五．誘導系統(tǒng)：
外源蛋白的誘導表達/沉默能很好比較本底和干預的區(qū)別，非常有力的詮釋目的基因/蛋白的作用機理，特別適合研究自身具有毒性的蛋白，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛使用。
可誘導蛋白表達/基因敲除細胞株構(gòu)建服務借助于真核表達載體/慢病毒系統(tǒng)，構(gòu)建含有“開關(guān)”控制表達/沉默目的基因的質(zhì)粒/病毒，通過電轉(zhuǎn)/感染在各種細胞基因組上整合載體，利用抗生素篩選，得到可誘導的穩(wěn)定細胞株，經(jīng)過32代的穩(wěn)定性QC檢測，完成基因敲除細胞株的構(gòu)建工作。
主要包含如下步驟:
1. 載體構(gòu)建（誘導質(zhì)粒載體、病毒載體）；
2. 轉(zhuǎn)染；感染；電轉(zhuǎn)；
3. “開關(guān)”誘導下目的蛋白初步檢測；
4. 抗生素篩選；
5. “開關(guān)”目的蛋白再次檢測（定性/半定量）；
6. 單克隆細胞株穩(wěn)定性檢測。
特殊的過表達蛋白/細胞。
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