中文字幕理论片,69视频免费在线观看,亚洲成人app,国产1级毛片,刘涛最大尺度戏视频,欧美亚洲美女视频,2021韩国美女仙女屋vip视频

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株（穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株）指能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)特定基因或干擾特定基因表達(dá)的細(xì)胞株。在基因功能的研究中，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株彌補(bǔ)了瞬時(shí)感染（或轉(zhuǎn)染）實(shí)驗(yàn)中外源基因表達(dá)時(shí)間短的缺陷，便于長(zhǎng)期觀察蛋白間相互作用以及基因?qū)?xì)胞功能的影響。構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性（最常用的有新霉素（Neomycin）、殺稻瘟菌素（Blasticidin）、嘌呤霉素（Puromycin）或G418）的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選混合陽(yáng)性克隆（針對(duì)轉(zhuǎn)染效率較高的細(xì)胞株）。有些細(xì)胞株轉(zhuǎn)染效率比較低，混合陽(yáng)性克隆蛋白表達(dá)降低或不均一不明顯，這種情況還需在陽(yáng)性混合克隆的基礎(chǔ)上得到單細(xì)胞長(zhǎng)出的陽(yáng)性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

慢病毒載體（Lentiviral vector，LVs）是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，可有效感染并進(jìn)入目的細(xì)胞，對(duì)分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞均具有較高的感染效率。它能高效的將目的基因（或shRNA）導(dǎo)入各種細(xì)胞系。慢病毒載體基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體。進(jìn)入細(xì)胞核后，目的基因或轉(zhuǎn)錄shRNA的DNA隨機(jī)整合到細(xì)胞基因組中，整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞漿中表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾。利用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選，可得到穩(wěn)定表達(dá)或沉默特定基因的細(xì)胞株。

（1）細(xì)胞檢測(cè)（細(xì)胞狀態(tài)是否良好、有無(wú)支原體污染等）。

（2）慢病毒包裝及純化：需要一個(gè)穿梭質(zhì)粒（攜帶目的基因） 、一個(gè)或兩個(gè)包裝質(zhì)粒（編碼病毒的核心蛋白、復(fù)制所需的酶和基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子等）以及一個(gè)包膜質(zhì)粒（編碼蛋白質(zhì)外殼）。配制轉(zhuǎn)染體系，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，并采用超濾濃縮或超速離心沉淀病毒液。

（3）病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥篩：提前摸索細(xì)胞的最佳MOI值，并對(duì)鋪板細(xì)胞進(jìn)行病毒液感染，如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染48小時(shí)后可見(jiàn)明顯熒光表達(dá)。在轉(zhuǎn)染3-4天后開(kāi)始對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加藥篩選。

注：為了達(dá)到最佳的實(shí)驗(yàn)效果，建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行3-4種不同MOI值感染預(yù)實(shí)驗(yàn)；對(duì)于同種細(xì)胞不同種抗生素或是不同細(xì)胞對(duì)同種抗生素的使用，也建議提前摸索最佳使用濃度。

圖2 我司慢病毒感染細(xì)胞效率實(shí)例

（4）穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的檢測(cè)：mRNA水平檢測(cè)（我司采用qRT-PCR法）。檢測(cè)合格后，對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)與凍存保種。

以上步驟為構(gòu)建多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系流程，若需構(gòu)建單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，則還需進(jìn)行以下步驟：

① 對(duì)篩選后的多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行流式分選，即分選出單克隆細(xì)胞；

② 單細(xì)胞經(jīng)過(guò)增殖后，繼續(xù)進(jìn)行第二輪篩選；

③ 篩選完成后，收集部分細(xì)胞進(jìn)行mRNA水平檢測(cè)，選擇結(jié)果正確的單克隆細(xì)胞凍存保種。

（1）能將外源基因有效整合進(jìn)宿主染色體中，外源基因表達(dá)水平高且穩(wěn)定；

（2）廣泛的宿主，幾乎可以感染所有類(lèi)型的細(xì)胞（可感染分裂和不分裂的細(xì)胞），特別適合質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞；

（3）適用范圍廣，可用于體外細(xì)胞系和活體動(dòng)物模型，研究基因和RNAi等；

（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的概率大大增加。

舒桐醫(yī)療科技有限公司擁有豐富的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)不同類(lèi)型和轉(zhuǎn)染效率的細(xì)胞以及需要表達(dá)的外源基因的大小，針對(duì)性地選擇病毒感染或者轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建。

參考文獻(xiàn)：

Neha Tandon,. et al. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018. 8(21): e3073.

Tomás HA,. et al. LentiPro26: novel stable cell lines for constitutive lentiviral vector production. Scientific Reports. 2018. 8(1):5271.

Ferreira MV,. et al. Progress and perspectivesin the development of lentiviral vector producer cells. BiotechnolJ. 2021. 16(1):2000017.