從20世紀(jì)50年代的巴氏涂片法到20世紀(jì)90年代的液基細(xì)胞學(xué)檢查方法，再到2000年的HPV檢測(cè)以及近年來(lái)出現(xiàn)的HPV基因分型、病毒載量、p16/ki-67和DNA甲基化、整合態(tài)等檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，使得宮頸癌篩查技術(shù)在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和生物標(biāo)志物檢測(cè)方面都取得了飛速的發(fā)展。HPV檢測(cè)主要基于分子生物學(xué)技術(shù)，包括核酸雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、雜交捕獲和基因芯片等方法。與細(xì)胞學(xué)檢查方法相比，HPV檢測(cè)初篩具有更高的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值，一次檢測(cè)陰性后的再篩查時(shí)間可延長(zhǎng)至3 ~ 5 年，但是HPV檢測(cè)初篩具有局限性，需對(duì)初篩結(jié)果陽(yáng)性的女性分流。目前借助細(xì)胞學(xué)檢查特異性高的特點(diǎn)，細(xì)胞學(xué)檢查是HPV檢測(cè)初篩陽(yáng)性的首選分流方法。而細(xì)胞學(xué)檢查方法本身亦有局限性，因此研究者仍在尋找最佳的分流策略。針對(duì)高危型HPV的定量檢測(cè)，常用的方法有HC2、熒光定量PCR技術(shù)和以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的其他方法。HC2是目前用于HPV半定量檢測(cè)的最常見方法，但是，一方面HC2不做分型，所以無(wú)法知道最終檢測(cè)的載量值是來(lái)源于單一型別，還是混合型別；另外，HC2不能對(duì)樣本細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)定，無(wú)法排除采樣差異導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量差異，使得載量無(wú)法做到與實(shí)際感染載量的客觀一致，也無(wú)法確保每次采樣的重復(fù)性。因此，早年大量應(yīng)用HC2測(cè)定病毒載量與宮頸病變的關(guān)系存在較大的爭(zhēng)議（如2007年Nature review的報(bào)道）。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)循環(huán)閾值（Ct值）和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。但因熒光定量PCR技術(shù)的敏感度及定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，各研究結(jié)論間沒(méi)有嚴(yán)格的可比性，這也是限制該技術(shù)迅速發(fā)展的主要原因。2019年，F(xiàn)DA官方文件確認(rèn)HPV病毒載量是與宮頸癌前病變相關(guān)的主要因素，尤其是alpha 9（A9組）家族的基因型，包括HPV16/31/33/52/58型。BMRT（碩世21HPV分型定量檢測(cè)）標(biāo)準(zhǔn)化定量，在檢測(cè)樣本中HPV病毒載量的同時(shí)，檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中的單拷貝基因。
通過(guò)檢測(cè)單拷貝基因數(shù)測(cè)算樣本中宮頸脫落細(xì)胞的數(shù)量，并比較同等細(xì)胞數(shù)量中的每一個(gè)HPV型別的病毒載量，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化定量。
北京大學(xué)深圳醫(yī)院吳瑞芳教授團(tuán)隊(duì)，基于全多中心的CHIMUST研究結(jié)果顯示，“16/18分型+其他高危型標(biāo)準(zhǔn)化定量”策略有著與經(jīng)典的細(xì)胞學(xué)分流策略相當(dāng)?shù)拿舾行院吞禺愋裕梢愿玫貪M足中國(guó)人群宮頸病變篩查的需求。
通常，在生理機(jī)能正常的細(xì)胞中，p16和Ki-67的表達(dá)會(huì)相互拮抗，不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)。如p16和Ki-67同時(shí)過(guò)表達(dá)，則提示RB蛋白失活、細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)、HPV感染是致癌性的。相關(guān)研究分別應(yīng)用p16/Ki-67雙染色法和細(xì)胞學(xué)檢查方法分流所有HPV陽(yáng)性或除16/18型HPV以外12種高危型HPV陽(yáng)性的女性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙染色法的篩查敏感性均高于細(xì)胞學(xué)檢查方法，可用作HPV陽(yáng)性女性的敏感且有效的分流方法。
ATHENA大樣本研究數(shù)據(jù)顯示：與經(jīng)典細(xì)胞學(xué)分流的策略相比，其他高危HPV陽(yáng)性結(jié)合p16/Ki-67雙染分流，其敏感性顯著提高，特異性相當(dāng)。DNA甲基化也是一種可用于篩查宮頸癌前病變的分子標(biāo)志物。目前有HPV病毒甲基化和人體基因甲基化研究。 目前，用于宮頸癌診斷的人體甲基化基因包括PAX1、SOX1、LMX1A和DAPK1。其中PAX1甲基化已被廣泛證實(shí)可用作CIN3+的分子標(biāo)志物。雖然DNA甲基化檢測(cè)在宮頸癌篩查方面表現(xiàn)出具有潛在的應(yīng)用前景，但由于DNA甲基化在宮頸癌前病變發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中所起作用的分子機(jī)制尚未明了，其廣泛用于宮頸癌篩查還需有更大量的臨床數(shù)據(jù)的支持。美國(guó)一項(xiàng)3萬(wàn)人入組的KNPC研究成果顯示：HPV52/39/45/59陽(yáng)性結(jié)合HPV DNA甲基化陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)高于陰道鏡轉(zhuǎn)診閾值，因此甲基化可有效進(jìn)行CIN3+風(fēng)險(xiǎn)分層，盡早發(fā)現(xiàn)宮頸病變。
荷蘭的一項(xiàng)研究表明：宮頸樣本和尿沉渣中的人體基因甲基化高度相關(guān)，比利時(shí)的一項(xiàng)研究結(jié)果則表明：高級(jí)別病變的患者中，首段尿液GHSR和LHX8基因的甲基化水平顯著升高。HPV DNA檢測(cè)及病毒在宿主體內(nèi)的生理狀態(tài)作為一項(xiàng)輔助性檢查成為目前研究的熱點(diǎn)。高危型HPV DNA整合往往導(dǎo)致其E1和E2區(qū)大部分缺失或中斷，E6和E7致癌基因過(guò)表達(dá)，宿主致癌基因激活和抑癌基因失活。目前研究發(fā)現(xiàn)，隨CIN級(jí)別升高，HPV整合發(fā)生率顯著升高。檢測(cè)病毒的整合狀態(tài)比單純檢測(cè)HPV似乎更具有臨床意義和價(jià)值，但還需進(jìn)一步大樣本前瞻性的研究。馬丁院士團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果表明：隨著CIN級(jí)別的升高，HPV與人體基因的整合發(fā)生率顯著上升，可用于宮頸癌篩查的風(fēng)險(xiǎn)分層和分流管理。
浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院呂衛(wèi)國(guó)團(tuán)隊(duì)研究了HPV病毒與人體基因不同的整合形態(tài)，新發(fā)現(xiàn)了一種整合態(tài)，即不含E6/E7基因的部分HPV基因組。宮頸癌篩查最佳策略標(biāo)準(zhǔn)為：能最大程度地篩查出宮頸病變，其敏感性和特異性都應(yīng)高。HPV分型檢測(cè)作為初篩，如何結(jié)合病毒載量、甲基化、p16/Ki-67、整合態(tài)等分流標(biāo)記物的優(yōu)點(diǎn)，制定合理的篩查流程，進(jìn)而制定適合中國(guó)國(guó)情的宮頸癌篩查技術(shù)，是我們需予思考與努力的方向。
[1]Woodman C B J, Collins S I, Young L S. The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues[J]. Nature Reviews Cancer, 2007, 7(1): 11-22.[2]HPV定量檢測(cè)的臨床意義與研究進(jìn)展[J]. 王軼英,王悅,孔北華,Wenxin Zheng. 中華婦產(chǎn)科雜志. 2017 (08).
