子宮頸癌篩查中 HPV 檢測的現(xiàn)狀與展望
王新宇 謝幸
【doi】10.13390/j.issn.1672-1861.2016.04.002
【作者單位】310006 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦瘤科
【通信作者】謝幸 E-mail：xiex@zju.edu.cn
自從 20 世紀(jì) 40 年代巴氏涂片開始被廣泛用于宮頸癌篩查以來，宮頸癌在發(fā)達(dá)國家的發(fā)生率與死亡率已顯著下降，但在發(fā)展中國家仍然為女性常見惡性腫瘤。眾所周知，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的特異性高、而敏感性低，盡管出現(xiàn)了液基細(xì)胞制片技術(shù)和TBS 診斷系統(tǒng)兩大進(jìn)展，但其基本特征沒有改變。人乳頭瘤病毒（HPV）的流行病學(xué)和功能學(xué)研究不僅明確了高危 HPV 持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的必需因素，也確立了 HPV 檢測成為細(xì)胞學(xué)檢查之后的第二個(gè)篩查手段。
一 HPV 檢測用于宮頸癌篩查的現(xiàn)狀
HPV 是一類 DNA 病毒，以人為唯一宿主，僅感染皮膚和黏膜，通過直接或間接接觸傳染。在已鑒定的 160 余種型別中，40 余種與女性生殖道感染有關(guān)。根據(jù)與宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性，可將 HPV分為高危型和低危型，其中已確定的 13 種高危型HPV 為 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68。采用核酸檢測技術(shù)可以檢測宮頸脫落細(xì)胞中感染的高危型 HPV。自 20 世紀(jì) 80 年代開始的大量臨床試驗(yàn)證明，HPV DNA 檢測對診斷 CIN2+ 有很高的敏感性（>95 %）和可接受的特異性（>80 %），HPV 陰性婦女的宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)很低，從而確定了 HPV DNA 檢測可用于宮頸癌篩查。1996 年，美國 FDA 批準(zhǔn)了第一個(gè)可用于宮頸癌篩查的 HPV 檢測技術(shù)，即雜交捕獲 2 代法（HC2）。2009 年以后，美國 FDA 先后認(rèn)證了其他兩種 HPV DNA 檢測技術(shù)，Cervista HPV（Invader酶切信號放大法）和 Cobas 4800（熒光定量 PCR法）。
HPV DNA 檢測最初用于宮頸細(xì)胞學(xué)初篩輕度細(xì)胞學(xué)異常（ASCUS）的分流和與細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合初篩。2008 年，EUROGIN 推 薦 HPV DNA檢測也可用于>25 歲婦女的初篩，篩查間隔為5 年。2014 年美國 FDA 批準(zhǔn) Cobas4800 檢測技術(shù)可用于 25 歲以上婦女的宮頸癌初篩，篩查間隔為 3 年。2015 年，ASCCP 和 SGO 推 薦 HPV 初 篩（Cobas4800）可用于現(xiàn)行宮頸癌篩查的替代方案。HPV 初篩的主要優(yōu)勢是：① HPV 初篩比細(xì)胞學(xué)初篩具有更高的敏感性，減少高級別病變的漏診率；② HPV 初篩比細(xì)胞學(xué)初篩有更高的陰性預(yù)測值，可延長篩查間期，增加篩查的成本效益；③即使與聯(lián)合篩查相比，HPV 初篩的敏感性也幾乎相近，也即 HPV 與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合初篩不增加持續(xù)性病變的檢出率[1-2]。
此外，HPV 初篩還具有其他優(yōu)勢，如減低了對細(xì)胞學(xué)醫(yī)師的依賴，適合于欠發(fā)達(dá)（特別是細(xì)胞學(xué)醫(yī)師缺乏）的國家或地區(qū)開展宮頸癌篩查；作為一種高敏感的檢測的技術(shù)，更適合于 HPV 疫苗大規(guī)模接種后宮頸癌發(fā)生率大幅下降的后疫苗時(shí)代；通過樣本自我采集，提高了受檢者的依從性[3]。但是，HPV 初篩也有不容忽視的臨床弊端，如增加陽性受檢者不必要的心理壓力、甚至造成創(chuàng)傷；過高的陰道鏡檢查率，甚至過度治療。最近還有報(bào)道，HPV DNA 初篩可能比細(xì)胞學(xué)初篩漏診更多的浸潤癌，漏診率 19% vs. 12%（98 vs.64 /526）[4]。
鑒于 HPV DNA 檢測缺點(diǎn)，對 HPV 初篩陽性婦女進(jìn)行分流是必須的。細(xì)胞學(xué)檢查是 HPV 初篩陽性首選的分流方法，利用細(xì)胞學(xué)高特異性的特點(diǎn)，可以中和 HPV 檢測過高的敏感性和過低的陽性預(yù)測值。流行病學(xué)研究顯示，HPV16/18 導(dǎo)致了約 70% 的宮頸鱗癌和 85% 的宮頸腺癌[5]。HPV 16/18 陽性的 CIN3 及以上病變的 10 年累計(jì)風(fēng)險(xiǎn)分別達(dá) 17.2% 和 13.6%，遠(yuǎn)高于其他高危型別（3.0%）[6]。HPV16/18 感染的宮頸癌高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提示了 HPV16/18 分型檢測有助于 HPV 初篩陽性的分流。美國 FDA（2014 年 4 月）批準(zhǔn)了 HPV16/18分型檢測（Cobas4800）可用于 HPV 初篩陽性的分流，陽性者直接推薦陰道鏡檢查。美國 FDA（2012 年）又批準(zhǔn)上市了一項(xiàng) E6/E7 m RNA 檢 測 技 術(shù)（Eptima HPV）。 已 知 E6/E7 m RNA 的 表 達(dá) 水 平 反 映 了 HPV 致 癌 基 因 的活躍狀態(tài)，E6/E7 持續(xù)高表達(dá)又是 HPV 致癌過程的關(guān)鍵事件，因此在理論上，E6/E7 m RNA 檢測 比 HPV DNA 檢 測 能 更 精 確 發(fā) 現(xiàn) 具 有 臨 床 重要性的感染[7]。臨床試驗(yàn)也顯示，與 4 種 HPV DNA 初 篩 相 比，E6/E7 m RNA（Eptima HPV）初篩的敏感性不變，但特異性更高（90.2% vs. 84.3%~87.2%），另外 E6/E7 m RNA 檢測陽性率為 10.3%，而 DNA 檢測的陽性率 13.4%~16.3%，從而降低了對一過性 HPV 感染的檢出率[8]。臨床 追 蹤 試 驗(yàn) 顯 示，E6/E7 m RNA 陰 性 的 CIN2+和 CIN3+ 的 3 年累計(jì)絕對風(fēng)險(xiǎn)值與 DNA 檢測相似，而陽性的累計(jì)絕對風(fēng)險(xiǎn)值更高，提示與 HPV DNA 初篩相比，E6/E7 m RNA 初篩具有相似的陰性預(yù)測值和更高的陽性預(yù)測值[9-10]。
現(xiàn)有 HPV 核酸檢測技術(shù)較多，各種方法均能檢測病毒感染。但用于宮頸癌篩查的 HPV 檢測的目的不是診斷是否病毒感染，而是預(yù)測是否存在高級別病變。根據(jù)中國 FDA 最近頒布的“人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則”（http://www.sfda.gov.cn/），一種用于宮頸癌篩查的理想的 HPV 檢測技術(shù)必須至少符合以下標(biāo)準(zhǔn)：① 檢測試劑應(yīng)有通過臨床試驗(yàn)獲得的理想的臨床靈敏度和臨床特異性的陽性判斷值，也即臨界值（Cutoff）；② 檢測的 HPV 型別應(yīng)涵蓋、且僅涵蓋 HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68 等 13 種高危型別，或加上 26，53，66，73，82 等 5 種中等風(fēng)險(xiǎn)型別；③ 分型檢測應(yīng)有臨床意義。已有研究數(shù)據(jù)證實(shí) 16、18 型的基因分型檢測有助于 HPV 陽性結(jié)果的分析，是有臨床意義的，但并非所有的HPV 分型檢測均有確定的臨床意義；④ 鑒于樣本采集方法不利于量值溯源，檢測試劑定位應(yīng)為定性檢測。
二 HPV 檢測用于宮頸癌篩查的展望
細(xì)胞學(xué)檢查是基于 HPV 感染所致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的一種檢測，而 HPV 檢測是針對病毒感染狀態(tài)的一種檢測。而事實(shí)上，HR-HPV 感染后，首先誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生一系列分子表達(dá)和功能的改變，繼而發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。所以，檢測 HPV 感染所致的宿主細(xì)胞內(nèi)各種分子變化將會(huì)作為 HPV檢測的衍生技術(shù)應(yīng)用于宮頸癌篩查，并在理論上，其敏感度和特異度均優(yōu)于 HPV 檢測和細(xì)胞學(xué)檢查。
1. p16/Ki-67 免疫組化雙染：p16（周期素激酶抑制基因）直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，在人類 50% 的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有缺失或突變。但在宮頸癌細(xì)胞中，p16 不缺失或突變，反而受 E7 調(diào)控而表達(dá)上調(diào)。Ki-67（細(xì)胞增殖指數(shù)）免疫組化染色可將大部分 G0 期以外的細(xì)胞標(biāo)記，Ki-67 陽性率越高，處于增殖周期的細(xì)胞比例越高。Uijterwaal 等[11]回顧性研究 p16/Ki-67 免疫組化雙染對 847 例 HPV 陽性 /細(xì)胞學(xué)陰性婦女的分流價(jià)值，p16/Ki-67 雙染診斷 CIN2/3 的敏感性高于 HPV16/18 分型（CIN3：73.3% vs. 46.7%、CIN2： 68.8% vs. 43.8%），特異度略低于 HPV16/18 分型（CIN3： 70.0 % vs. 78.3%、CIN2：72.8% vs. 79.4%），p16/Ki-67 陰性者 CIN3 的 5 年累計(jì)風(fēng)險(xiǎn) 3.3%，與 HPV16/18陰性相似（3.6%）。單一 p16 檢測（FISH）也可用于 HPV 陽性分流，與細(xì)胞學(xué)相比，預(yù)測 CIN2及以上病變的敏感性更好（87.75% vs. 52%），準(zhǔn)確性更高（84.80% vs.74.34%），陰性預(yù)測值更高（95.20% vs. 74.10%）[12]。但也有作者通過文獻(xiàn)回顧，認(rèn)為尚無足夠證據(jù)推薦 p16/Ki-67 雙染可用于 ASCUS 和 LSIL 婦女的分流[13]。
2. hTERC基因檢測： 端 粒 是 一 種 存 在 于真核細(xì)胞染色體末端的短而重復(fù)的非轉(zhuǎn)錄序列（TTAGGG），用于保護(hù)染色體末端免于融合和退化，但隨每次細(xì)胞分裂而縮短，被稱為真核細(xì)胞生物鐘。端粒酶（telomerase）是一種酶逆轉(zhuǎn)錄酶，能延長縮短的端粒，在惡性腫瘤細(xì)胞中活性增強(qiáng)，人類染色體端粒酶基因（h TERC）位于 3q26.3。E6 能激活 h TERC，導(dǎo)致細(xì)胞永生化。已有多篇報(bào)道顯示，h TERC 擴(kuò)增率隨宮頸病變加重而升高，比細(xì)胞學(xué)檢查和 HPV 檢測有更高的準(zhǔn)確性、特異性和陽性預(yù)測值。但所有研究均為非真正意義的臨床試驗(yàn)，其臨床意義有待進(jìn)一步驗(yàn)證[14]。
3. DNA 甲基化檢測：表觀遺傳學(xué)指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化，DNA 甲基化為表觀遺傳學(xué)重要內(nèi)容。HPV 病毒基因和宿主細(xì)胞基因表達(dá)均可通過 DNA 甲基化方式調(diào)控。有研究對 114 例 HPV16 陽性患者（包括細(xì)胞學(xué)正常至 SCC）檢測 L1 基因甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基化水平隨著病變加重而升高，預(yù)測 CIN2+ 的敏感度91.7% ，特異度 59.5%，HPV16 L1 甲基化檢測可能成為 HPV16 陽性婦女的分流方法[15]。Verhoef等[16]報(bào)道，1 038 例 HPV 陽性婦女，隨機(jī)分為 515例甲基化檢測，509 例細(xì)胞學(xué)檢查，甲基化檢測預(yù)測CIN2 及以上的 RR 為 1.19（95% CI 0.90~1.57），平均診斷時(shí)間 96 d（44~101 d） vs.158 d（71~222 d），認(rèn)為甲基化檢測和細(xì)胞學(xué)檢查對 HPV 陽性婦女的分流效率相當(dāng)，但更快捷。
4.mi RNA 檢測：mi RNA 是一類含 20~22 個(gè)核苷酸序列的微小非編碼 RNA，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。占人類基因組 3% 的 mi RNA 調(diào)控 30% 的人類基因。mi RNA 芯片和 RT-PCR 驗(yàn)證顯示，在宮頸病變和宮頸癌中 mi RNA 表達(dá)譜改變。功能學(xué)研究顯示，多種 mi RNA 參與了 HPV致癌的過程。Tian 等[17]收集 1 021 例 HPV 陽性婦女，檢測宮頸脫落細(xì)胞 mi R-424，mi R-375，mi R-218，mi R-34a，mi R-92a，mi R-93 表達(dá)，陰道鏡下活檢為金標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞學(xué)檢查為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸脫落細(xì)胞 mi R-424 和 mi R-375 單一或聯(lián)合檢測顯示了比細(xì)胞學(xué)檢查更好的 HPV 初篩陽性的分流效能。
以上各種 HPV 感染相關(guān)的各種分子標(biāo)志物檢測顯示了廣闊的臨床應(yīng)用前景，代表了宮頸癌篩查新技術(shù)開發(fā)的未來方向，但能否真正應(yīng)用于宮頸癌篩查，包括一線初篩和二線分流，尚需更多、更大樣本臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。
【參考文獻(xiàn)：略】
本文刊載于《中國婦產(chǎn)科臨床雜志》2016年第17卷第4期，歡迎大家閱讀下載，媒體轉(zhuǎn)載請標(biāo)明出處。
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