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約翰-韋恩（John Venn，1834-1923）1834年生于英格蘭約克郡赫爾市，父親是亨利-韋恩，母親是瑪莎-賽克斯。小韋恩很不幸，母親在他三歲的時(shí)候就去世了。小韋恩的父親是一個(gè)新教的追隨者，一生擔(dān)任牧師以及其他教職。小韋恩從小被嚴(yán)格培養(yǎng)，希望能夠繼承父業(yè)成為牧師。小韋恩19歲（1853）時(shí)入讀劍橋大學(xué)岡維爾凱斯學(xué)院，對現(xiàn)代人來說有幾個(gè)名人出自這一學(xué)院，一個(gè)是發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)的威廉-哈維（WilliamHarvey），他比小韋恩要早150年！還有一個(gè)現(xiàn)在仍健在的傳奇大物理學(xué)家霍金，當(dāng)然他比小韋恩要晚100年！。韋恩1857年畢業(yè)，1859年成為牧師，并于1862年回到劍橋成為講師講授倫理道德科學(xué)。約翰-韋恩的主要興趣在邏輯學(xué)，他先后發(fā)表了幾篇這方面的文章。1866年，他發(fā)表了“TheLogic of Chance”，在文中他引入了概率中的頻率理論；1881年他發(fā)表了“Symbolic Logic”，在文中他正式介紹了韋恩圖；他還在1889年發(fā)表了“ThePrinciples of Empirical Logic”。1883年，約翰-韋恩被選為皇家學(xué)會(huì)成員。1923年，約翰-韋恩逝于劍橋。約翰-韋恩有一個(gè)兒子，名字也叫約翰-韋恩，是英國經(jīng)濟(jì)學(xué)家，并擔(dān)任很長時(shí)間的劍橋大學(xué)女王學(xué)院院長。上面是約翰-韋恩的照片，看上去非常嚴(yán)肅，想象中邏輯學(xué)家就應(yīng)該是這個(gè)樣子。下面是那個(gè)著名的彩色玻璃窗。在劍橋大學(xué)Caius 學(xué)院的彩色玻璃窗上有為了紀(jì)念約翰-韋恩而制作的圖案，他從1903年起一直擔(dān)任Caius學(xué)院的院長直到逝世。韋恩圖是用于顯示元素集合重疊區(qū)域的圖示。它既可以表示一個(gè)獨(dú)立的集合，也可以表示集合與集合之間的相互關(guān)系。最常見的是三元韋恩圖，上過美術(shù)課就一定會(huì)記住。這個(gè)圖表示了三個(gè)集合之間可能的所有組合。那么四個(gè)集合就是文章中所用的橢圓形式了：注意到了么？在三元韋恩圖中最大的不同集合數(shù)是7；在四元中這個(gè)數(shù)是15；在五元中這個(gè)數(shù)是多少，為什么？韋恩圖也創(chuàng)造了數(shù)學(xué)問題，最著名的是對稱問題，就是滿足什么樣條件的韋恩圖是對稱的呢？答案是質(zhì)數(shù)元素的韋恩圖是對稱的。來個(gè)n=5 看看：看著沒那么復(fù)雜，不過你可以知道，直到今天，還常?？梢砸姷接嘘P(guān)韋恩圖的數(shù)學(xué)問題討論發(fā)表在頂級(jí)學(xué)術(shù)雜志上。好了，我們回來看文章！50個(gè)預(yù)測的環(huán)狀RNA的特性通過實(shí)驗(yàn)在HEK293細(xì)胞中驗(yàn)證我們對環(huán)狀RNA的預(yù)測。反轉(zhuǎn)錄后通過實(shí)時(shí)PCR檢測頭對尾的剪接，使用不同引物進(jìn)行Sanger序列測定（圖2ab）。在環(huán)狀RNA隨機(jī)選擇的23個(gè)剪接位點(diǎn)中19個(gè)得到了驗(yàn)證（83%），說明了我們方法的準(zhǔn)確性高（表1）。相反，在白細(xì)胞中預(yù)測的7個(gè)環(huán)狀RNA中有5個(gè)在HEK293中檢測不到，說明了環(huán)狀RNA表達(dá)的特異性。頭對尾的剪接也可能由反式剪接或基因組重排產(chǎn)生。為排除這些可能性以及可能產(chǎn)生的PCR人工產(chǎn)物，我們成功地通過RNaseR驗(yàn)證了人的環(huán)狀RNA的非敏感性，RNaseR是一種降解線性RNA分子的核酸外切酶，我們通過NorthernBlot，采用跨頭對尾剪接位點(diǎn)的探針，驗(yàn)證了RNaseR對人的環(huán)狀RNA沒有降解作用（圖2c）。我們定量測定了21個(gè)環(huán)狀RNA對RNaseR的抗性，而且通過qPCR驗(yàn)證了頭對尾的剪接。所有測量的環(huán)狀RNA至少比GAPDH對RNaseR的抗性高10倍（圖2d，補(bǔ)充圖2a）。我們推測環(huán)狀RNA應(yīng)該比mRNA正常情況下翻轉(zhuǎn)慢得多。確實(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在阻止轉(zhuǎn)錄24小時(shí)后環(huán)狀RNA仍然非常穩(wěn)定，穩(wěn)定程度超過內(nèi)參基因GAPDH（圖2e，補(bǔ)充圖2b）。在小鼠的腦組織中，我們也驗(yàn)證了與人同源的小鼠的環(huán)狀RNA（3/3）。在線蟲中，從生殖細(xì)胞和早期胚胎中預(yù)測的20個(gè)環(huán)狀RNA有15個(gè)在混合的樣品中得到了驗(yàn)證（補(bǔ)充圖2d，補(bǔ)充表3）。Figure 2 | CircRNAs are stable transcripts with robustexpression. a, Human(hsa) ZRANB1 circRNA exemplifies the validationstrategy. Convergent (divergent) primers detect total (circular) RNAs. Sanger sequencing confirms head-to-tail splicing. b, Divergent primers amplify circRNAs in cDNA but not genomic DNA(gDNA). GAPDH, linear control, size marker in base pairs. c, Northern blots of mock (2) and RNase R (1) treated HEK293 total RNA with head-to-tial specific probes for circRNAs. GAPDH, linear control. d,e, circRNAs are at least 10-fold more RNase R resistant than GAPDH mRNA (d) and stable after 24 h transcription block (e) (qCPR; error bars indicate standard deviation).圖2 環(huán)狀RNA具有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物和表達(dá)a，人的ZRANB1 環(huán)狀RNA驗(yàn)證策略示范圖。收斂（擴(kuò)散）引物探測到整個(gè)環(huán)狀RNAs。Sanger測序證實(shí)頭對尾的剪接。b，擴(kuò)散引物在cDNA中擴(kuò)增環(huán)狀RNA，不擴(kuò)增基因組DNA（gDNA）。GAPDH是線性對照。

c，Northern Blot, GAPDH 作為對照。d，e，環(huán)狀RNA比GAPDHmRNA 對RNaseR的抗性至少高10倍。圖2總評：工作量及技術(shù)含量都不大，屬于過渡階段數(shù)據(jù)，沒有太多值得討論的地方。環(huán)狀RNA CDR1as 與AGO蛋白密集地結(jié)合帶有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物可以以“miRNA海綿”的方式起作用。我們把環(huán)狀RNA的目錄與轉(zhuǎn)錄物的注釋結(jié)合起來分析，并假設(shè)成熟環(huán)狀RNA中沒有內(nèi)含子。我們篩選與保守miRNA家族種子匹配的保守序列。（在方法中作者介紹了具體的做法，就是將環(huán)狀RNA作為靶序列，普查有哪些已知的miRNA可以與其作用。一個(gè)假定的miRNA靶點(diǎn)是一個(gè)6個(gè)核苷酸長的序列，這個(gè)序列與成熟的miRNA上第2到第7位的序列呈反式互補(bǔ)。同時(shí)補(bǔ)充說明，通常情況下稱之為保守的。）當(dāng)對同一個(gè)miRNA家族進(jìn)行保守匹配計(jì)數(shù)時(shí)，與編碼序列或3’端UTR序列相比環(huán)狀RNA明顯富集（P<2.96 X 10 -22, n = 3,873; P < 2.76 X 10 -21, n =3,182; Mann-Whitney U-test）。作為一個(gè)極端的例子，我們發(fā)現(xiàn)已知的人的環(huán)狀CDR1as 上具有許多保守的miR-7的種子匹配（即結(jié)合位點(diǎn)）。為檢測CDR1as是否與miRNA結(jié)合，我們分析了miRNA效應(yīng)子AGO蛋白的生物化學(xué)，在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組范圍的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)。我們對人的AGO作了四次獨(dú)立的PAR-CLIP（photoactivatable-ribonucleoside-enhancedcrosslinking and immunoprecipitation）實(shí)驗(yàn)，而且將結(jié)果與發(fā)表過的數(shù)據(jù)相結(jié)合。PAR-CLIP 主要基于通過紫外將RNA與蛋白交聯(lián)，然后對結(jié)合到特異的RNA結(jié)合蛋白上的RNA進(jìn)行測序。在大量高密度的AGOPAR-CLIP的讀數(shù)中，長度為1.5kb的CDR1as 基因位點(diǎn)脫穎而出（圖3a），而其他九個(gè)合并的檢測其他RNA結(jié)合蛋白庫的讀數(shù)基本不存在。需要注意，CDR1基因正義編碼的轉(zhuǎn)錄物沒有產(chǎn)生PAR-CLIP讀數(shù)，這個(gè)轉(zhuǎn)錄物起初是從類腫瘤性小腦變性（paraneoplasticcerebellar degeneration）患者體內(nèi)以自抗體的攻擊目標(biāo)驗(yàn)證出來的。對于32個(gè)脊椎動(dòng)物的序列分析發(fā)現(xiàn)，miR-7是具有保守種子匹配的唯一的動(dòng)物miRNA，這樣可以解釋AGO與CDR1as轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合。人的CDR1as包含74個(gè)miR-7種子匹配，其中的63個(gè)至少在一種其他生物中存在。不同位點(diǎn)間的保守性很小，說明miR-7的結(jié)合位點(diǎn)可能具有功能性（圖3b）。對預(yù)測的環(huán)狀RNA-miRNA復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明種子外miR-7減少的堿基配對（圖3c）。32種脊椎動(dòng)物序列中有大約1500個(gè)miR-7的互補(bǔ)位點(diǎn)，但在miR-7位置12以外則沒有一個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)的存在（只有三個(gè)可以形成一個(gè)11個(gè)核苷酸的雙層復(fù)合物）（補(bǔ)充表4）。哺乳動(dòng)物Argonaute蛋白的切割需要10和11位的互補(bǔ)，而且依賴12位以外的延伸互補(bǔ)。這樣，CDR1as似乎正好可以大量結(jié)合miR-7而又不被miR-7所切割。單分子成像技術(shù)展示了分散的，大多數(shù)情況下處于細(xì)胞質(zhì)中的CDR1as的表達(dá)（HEK293細(xì)胞中），這與它miRNA海綿功能相一致（圖3d，補(bǔ)充表5）。通過NorthernBlot 檢驗(yàn)了CDR1as的成環(huán)性（圖3e）。缺口實(shí)驗(yàn)證實(shí)了環(huán)狀CDR1as可以被線性化而且會(huì)被降解（補(bǔ)充圖5a）。在HEK293細(xì)胞的RNA中，除了環(huán)狀CDR1as外沒有檢測到線性的CDR1as（補(bǔ)充圖5b）。對環(huán)狀RNA的表達(dá)水平進(jìn)行了定量測定，方法是實(shí)時(shí)PCR，使用發(fā)散性引物，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量（補(bǔ)充表6）。CDR1as表達(dá)量很高（15-20%對GAPDH的表達(dá)，圖3f）。通過HEK293RNA-seq 的數(shù)據(jù)，估算GAPDHmRNA的拷貝數(shù)（大約每個(gè)細(xì)胞1400個(gè)分子）可以知道每個(gè)細(xì)胞中CDR1as可能最多結(jié)合20,000個(gè)miR-7分子。如果CDR1as的功能是miR-7的海綿，那么它的破壞將會(huì)引發(fā)miR-7目標(biāo)的表達(dá)下調(diào)。我們在HEK293細(xì)胞中敲除了CDR1as，然后檢測發(fā)表過的miR-7目標(biāo)基因的表達(dá)，使用的方法是實(shí)時(shí)定量PCR，采用外部尖刺的標(biāo)準(zhǔn)。所有的八個(gè)miR-7的目標(biāo)基因都下調(diào)了，內(nèi)參基因也都下調(diào)了。另外，微串（nanostring）技術(shù)證實(shí)有許多基因下調(diào)了。還有，通過病毒引入小發(fā)夾RNA的方法穩(wěn)定減少CDR1as的表達(dá)引起體外創(chuàng)傷修復(fù)中細(xì)胞遷移的明顯減少（補(bǔ)充圖5阿附，補(bǔ)充表7）。這樣，敲除CDR1as會(huì)影響HEK293細(xì)胞，但我們無法說明這是miR-7的特異性作用，因?yàn)樗赡苁欠侵苯拥?，或者是不依賴于miR-7的CDR1as的功能。

Figure 3 | The circRNA CDR1as is bound by the miRNAeffector protein AGO, and is cytoplasmic. a, CDR1as is densely bound by AGO (red) but not by unrelatedproteins (black). Blue boxes indicate miR-7 seed matches. nt, nucleotides. b, c, miR-7 sites display reducednucleotide variability across 32 vertebrate genomes (b) and high base-pairing probability within seed matches (c).圖3 環(huán)狀CDR1as與miRNA效應(yīng)子蛋白AGO結(jié)合，環(huán)狀CDR1as存在于細(xì)胞質(zhì)中。a，CDR1as密集地與AGO（紅色）結(jié)合，但不與不相關(guān)蛋白（黑色）結(jié)合。藍(lán)色區(qū)域是miR-7種子匹配區(qū)。b，c，在32種脊椎動(dòng)物基因組中miR-7位點(diǎn)展示減少的核苷酸可變性（b）；以及在種子匹配中堿基的高配性（c）。d, CDR1as RNA is cytoplasmic and disperse (whitespots; singlemolecule RNA FISH; maximum intensity merges of Z-stacks). siSCR, positive; siRNA1, negative control. Blue,nuclei (DAPI); scale bar, 5 mm (see also Supplementary Fig. 10for uncropped images). e, Northern blotting detects circularbut not linear CDR1as in HEK293 RNA. Total, HEK293 RNA; circular, head-to-tail probe; circ1lin, probe within splice sites; IVTlin., in vitro transcribed, linear CDR1as RNA. f, Circular CDR1as is highly expressed (qPCR, error bars indicate standard deviation). g, CDR1as. Blue, seed matches; darderd, AGO PAR-CLIP reads; bright red, cross linked nucleotide conversions.d，CDR1asRNA 是處于細(xì)胞質(zhì)中分散的。（白點(diǎn)；單分子RNAFISH）e，NorthernBlot 在HEK293細(xì)胞RNA中檢測到環(huán)狀CDR1as但沒有線性CDR1as。f，環(huán)狀CDR1as是高度表達(dá)的。g，CDR1as 示意圖。藍(lán)色，種子匹配；暗紅，AGOPAR-CLIP閱讀；鮮紅，交聯(lián)的核苷酸形式。圖3評論：圖3主要展示CDR1as的性質(zhì)，說明它在細(xì)胞質(zhì)中的存在情況。值得注意的是其中采用了單分子成像技術(shù)。由其性質(zhì)，文中強(qiáng)調(diào)的與miR-7結(jié)合的特點(diǎn)，引出下面有關(guān)的功能上的內(nèi)容。CDR1as與miR-7在腦組織中的共表達(dá)如果CDR1as確實(shí)與miR-7具有相互作用，那么它們一定是共表達(dá)存在的。miR-7在神經(jīng)組織，胰腺和腦垂體中具有很高的表達(dá)水平。HEK293可能是一種從胚胎腎中神經(jīng)細(xì)胞前體衍生的細(xì)胞系，除此之外，我們定量分析了CDR1as和miR-7在不同的小鼠組織以及胰島分化的MIN6細(xì)胞中的表達(dá)情況（圖4a）。CDR1as和miR-7在腦組織中都具有高表達(dá)水平，但CDR1as在非神經(jīng)組織中表達(dá)很低或沒有表達(dá)，包括miR-7高表達(dá)的其他組織。qPCR數(shù)據(jù)說明CDR1as僅僅在成年和胚胎的小鼠腦組織中是呈環(huán)狀的（補(bǔ)充圖5gh）。這樣，CDR1as與miR-7似乎在神經(jīng)組織中特異性地進(jìn)行相互作用。確實(shí)，通過原位雜交方法，我們在胚胎小鼠（E13.5）的腦組織中發(fā)現(xiàn)CDR1as和miR-7具有相似但不完全相同的表達(dá)模式（圖4b）。非常特異地，CDR1as和miR-7在發(fā)育的中腦區(qū)域具有共同高表達(dá)的特點(diǎn)。因此，CDR1as是高表達(dá)的，穩(wěn)定的，存在于細(xì)胞質(zhì)中的，不呈線性存在而且與miR-7共享表達(dá)結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀RNA分子。這些性質(zhì)再加上CDR1as中存在的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，說明CDR1as是神經(jīng)組織中可能的環(huán)狀的miR-7的海綿。

Figure 4 | CDR1as and miR-7 have overlapping and specificexpression in neuronal tissues. a,Among mouse tissues and MIN6 cells (qPCR, relative to cerebral cortexexpression; error bars indicate standard deviations; see Supplementary Fig. 9afor miR-122 control) neuronal tissues co-express miR-7 and CDR1as. b, Insitu staining of CDR1asand miR-7 in mouse embryo brain E13.5 (U6 and miR-124, positive control;scrambled probe, negative control). Scale bar, 1mm.圖4 CDR1as與miR-7在神經(jīng)組織中具有重疊和特異性的表達(dá)。a，小鼠組織以及MIN6細(xì)胞中CDR1as和miR-7的共表達(dá)情況，qPCR數(shù)據(jù)（以大腦皮層的表達(dá)為參照）。b，小鼠胚胎（E13.5）腦的CDR1as和miR-7的原位雜交圖。圖4總結(jié)：圖4進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了CDR1as的性質(zhì)，即在組織中的表達(dá)分布，工作量很大。另外要注意到的一個(gè)細(xì)節(jié)是miR-7在Colon中具有很高的表達(dá)，但CDR1as則沒有，說明在Colon中有類似CDR1as的其他功能分子的存在。還有在cortex和hippocampus中CDR1as的表達(dá)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于miR-7，說明CDR1as可能還有其他的功能。miR-7 和CDR1as在斑馬魚中的作用如果在動(dòng)物模型中敲除CDR1as則會(huì)提供很多信息。然而，這種敲除將會(huì)影響到CDR1蛋白，那樣的結(jié)果是未知的。如果使用斑馬魚做動(dòng)物模型則可以克服這個(gè)問題。根據(jù)我們的生物信息學(xué)分析，斑馬魚的cdr1的位點(diǎn)是缺失的，而miR-7卻在胚胎腦組織中高度表達(dá)。因此，我們可以檢測是否miR-7會(huì)產(chǎn)生一種功能失去的表型，能否使用引入哺乳動(dòng)物CDR1asRNA的方法來誘導(dǎo)這種功能缺失表型的發(fā)生。在使用9ng劑量的miR-7嗎啉代時(shí)，胚胎并沒有整體上的形態(tài)缺失變化，但分別在兩種不同的，獨(dú)立的遺傳背景下可以重復(fù)性地產(chǎn)生腦發(fā)育缺陷現(xiàn)象（圖5ab）。特別是，70%的樣本清晰一致地具有中腦體積減少的現(xiàn)象，另外還有5%的樣本完全失去了中腦。需要說明的是，處于大腦前側(cè)的端腦（encephalon）的體積并沒有受到影響。通過共聚焦三維堆積方法對整個(gè)大腦的體積也都作了測量（圖5c，補(bǔ)充圖7）。中腦體積的減少與其他動(dòng)物miR-7被抑制的現(xiàn)象時(shí)一致的（補(bǔ)充圖6d）。這些數(shù)據(jù)說明miR-7功能缺失導(dǎo)致中腦體積的減少。為檢測CDR1as是否在體內(nèi)可以像miR-7的海綿樣具有功能，我們在斑馬魚的胚胎中注射兩種質(zhì)粒，一種是可以表達(dá)線性CDR1as的，另一種是可以在人細(xì)胞中表達(dá)環(huán)狀CDR1as的（圖5de）。qPCR確定在斑馬魚中表達(dá)了環(huán)狀CDR1as，而這些魚可重復(fù)性地發(fā)生了中腦體積減少的現(xiàn)象（圖5gh）。同樣，在小鼠中注射體外轉(zhuǎn)錄的部分小鼠CDR1asRNA但不是從另一條鏈上來的RNA可以明顯減少中腦的體積（補(bǔ)充圖6gi）。因此這一表型是由CDR1asRNA引起的，而不是非特異性RNA或DNA注射引起的。這些結(jié)果提供證據(jù)說明人/小鼠CDR1as轉(zhuǎn)錄物在體內(nèi)是具有生物活性的，可以產(chǎn)生像miR-7被抑制那樣的對腦發(fā)育的損傷。中腦體積的減少可以通過注射miR-7前體部分恢復(fù)（圖5fg），說明CDR1as表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)至少部分由其與miR-7的相互作用而產(chǎn)生。

Figure 5 | In zebrafish, knockdown of miR-7 or expressionof CDR1as causes midbrain defects. a, b, Neuronal reporter (Tg(huC:egfp)) embryos (top, light microscopy) 48h post fertilization (bottom, representative confocal z-stack projections; blue dashed line, telencephalon (TC)(control); yellowdashed line, midbrain (MB)). Embryos after injection of 9 ngmiR-7 morpholino (MO) (b) display a reduction in midbrainsize. Panel a shows a representative embryoinjected with 15 ng control morpholino. c,Threedimensional volumetric reconstructions. d,Emptyvector control. e, Expression vector encoding human circular CDR1as. f, Rescue experiment with miR-7 precursor. g, Phenotype penetrance (% of embryos, miR-7 MO, n=135; uninjected, n=83; empty vector, n=91; linear CDR1as, n=258; circular CDR1as, n=153; circular CDR1as plus miR-7 precursor, n=217). phenotype distribution derived from at least three indepenent experiments. Scale bar, 0.1mm. ** P<0.01; ***P<0.001 in Student t-test for normal midbrain, reduced midbrain (see also Supplementary Fig.6). h, Phenotype quantification (Methods). Error bars indicate standard deviation n=3 per group.圖5 斑馬魚中通過CDR1as敲除miR-7導(dǎo)致中腦缺陷。a，b，受精48小時(shí)后胚胎神經(jīng)元報(bào)道基因代表性共聚焦z-軸堆積成像；藍(lán)色虛線，端腦（對照）；黃色虛線，中腦。注射9ngmiR-7 嗎啉代（morpholino,MO）（b）顯示中腦體積減少。組圖a表示注射15ng對照嗎啉代。c，三維體積重建。d，空質(zhì)粒對照；e，表達(dá)人環(huán)狀CDR1as；f，恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用miR-7前體；g，表型外顯率（胚胎%，miR-5MO，n=135；未注射，n=83；空質(zhì)粒，n=91；線性CDR1as，n=258；環(huán)狀CDR1as，n=153；環(huán)狀CDR1as+miR-7前體，n=217）。h，表型定量統(tǒng)計(jì)。圖5總結(jié)：這是本文第二賣點(diǎn)，相當(dāng)于做了一個(gè)knock-out鼠之后發(fā)現(xiàn)它是 lethal的，算是很大的發(fā)現(xiàn)。圖很一般，就是要說明環(huán)狀CDR1as的功能，作為miR-7的海綿，作用結(jié)果使中腦發(fā)育缺陷。值得注意的是，由于表型決定了CDR1as功能的重要性，也就決定了這篇文章的重要性，因此對于表型的鑒定還是很認(rèn)真地，算了一下，總共統(tǒng)計(jì)中有937個(gè)zebrafish的胚胎處理，工作量還是很大的。討論我們已經(jīng)顯示了在動(dòng)物基因組不同位置有幾千個(gè)環(huán)狀RNA的表達(dá)（比如，從編碼和非編碼外顯子中，基因間區(qū)域或轉(zhuǎn)錄反義到5’和3’UTRs），它們的表達(dá)呈復(fù)雜的組織特異，細(xì)胞類型特異，或是發(fā)育階段特異的方式。我們提供的證據(jù)說明CDR1as在腦組織中通過與miR-7的結(jié)合而充當(dāng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)解物的作用：（1）CDR1as 密集地與miRNA效應(yīng)因子分子結(jié)合；（2）CDR1as含有74個(gè)miR-7種子匹配位點(diǎn)，大多高度保守；（3）CDR1as呈高表達(dá)，穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中；（4）CDR1as與miR-7在小鼠胚胎腦組織中共享特異性表達(dá)區(qū)域；（5）人/小鼠的CDR1as在體內(nèi)呈環(huán)狀形式，線性物檢測不到；（6）人/小鼠的CDR1as注射到斑馬魚中會(huì)在腦中出現(xiàn)與miR-7敲除相似的表型。也許斑馬魚對人的CDR1as的成環(huán)作用不完全，但與線性CDR1as相比較，中腦的表型還是很明顯的。雖然兩種DNA質(zhì)粒攜帶的是同一個(gè)啟動(dòng)子，以相同的劑量進(jìn)行注射，我們?nèi)匀徊荒芘懦心X發(fā)育缺陷是由其他因素引起的可能。但是由于CDR1as或環(huán)狀RNA異常的穩(wěn)定性，我們的數(shù)據(jù)說明環(huán)狀RNA可以用作miRNA或RBP的抑制劑。以后的研究應(yīng)該闡明CDR1as如何線性化然后靶定目標(biāo)進(jìn)行降解的。miR-671可以誘導(dǎo)CDR1as的降解，因此CDR1as可能的功能是將miR-7帶到亞細(xì)胞區(qū)域，在那里miR-671可以促進(jìn)其釋放miR-7。已知的miR-7目標(biāo)比如PAK1和FAK1的功能支持這種想法。在斑馬魚中由于CDR1as表達(dá)引起的表型通過表達(dá)miR-7只能部分地恢復(fù)，說明CDR1as的功能不只是捕獲miR-7。這一想法得到的實(shí)驗(yàn)支持是在成年小鼠腦海馬部位原位雜交顯示只有CDR1而沒有miR-7的信號(hào)（補(bǔ)充圖9b）。那么環(huán)狀RNA除了成為海綿之外還可能有什么功能呢？作為單鏈RNA，CDR1as可能，比如，與目標(biāo)mRNA的反式3’UTRs結(jié)合來調(diào)節(jié)其表達(dá)。甚至可能miR-7與CDR1as的結(jié)合是為沉默這些反式作用活動(dòng)。還有，CDR1as可能與大的RNA或蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝相關(guān)，也許與其他低復(fù)雜性分子具有相似性。還有多少個(gè)其他環(huán)狀RNA存在呢？在本研究中，我們通過序列數(shù)據(jù)確認(rèn)了人有2,000；小鼠有1,900；線蟲有700個(gè)環(huán)狀RNA；而且我們通過實(shí)驗(yàn)確證了最常見的50個(gè)。然而我們只是通過一些具有局限性的簡易手段檢測了幾個(gè)組織/發(fā)育階段的情況。因此，真正的環(huán)狀RNA的數(shù)量要大得多。盡管CDR1as是一個(gè)極端的例子，但許多環(huán)狀RNA都具有保守的種子匹配。比如，SRY位點(diǎn)產(chǎn)生的環(huán)狀RNA具有小鼠miRNA的種子位點(diǎn)。因此，環(huán)狀RNA可能與其他RNA競爭與miRNA的結(jié)合。序列分析表明當(dāng)編碼外顯子表達(dá)環(huán)狀RNA時(shí)，它就承擔(dān)了額外的可能的調(diào)節(jié)功能，而基因間或內(nèi)含子產(chǎn)生的環(huán)狀RNA則通常只顯示弱保守性。由于我們檢測了成千的環(huán)狀RNA，因此會(huì)有趣地推測到外顯子隨機(jī)的成環(huán)作用很容易得到進(jìn)化，而且可能為得到穩(wěn)定的表達(dá)良好的具有調(diào)節(jié)功能的RNA的快速進(jìn)化提供一個(gè)機(jī)理。還要提醒的是，我們在人的環(huán)狀RNA中檢測到了許多病毒miRNA的種子匹配。然而，沒有理由認(rèn)為環(huán)狀RNA的主要功能一定是與miRNA結(jié)合。比如像在細(xì)菌中，miRNA海綿的捕獲機(jī)制對RBP同樣重要。同樣，環(huán)狀RNA可以存儲(chǔ)，分類或找到RBP。概括來說，我們的數(shù)據(jù)說明環(huán)狀RNA形成了一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)物，它們可以和其他RNA競爭與miRNA和RBP的結(jié)合，通常情況下的功能是調(diào)節(jié)局部的RBP，RNA或其位點(diǎn)的濃度。另注：本文審閱過程中，成纖維細(xì)胞中環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)。(正文完)當(dāng)期專家評論：Title: Circlesreshape the RNA world題目：圓圈重塑RNA世界Abstract Theversatility of RNA seems limitless. The latest surprise comes from circularRNAs, which are found to counteract the function of another class of regulatoryRNA –the microRNAs.摘要 RNA的多樣性似乎沒有邊界。最新的驚奇來自環(huán)狀RNA，發(fā)現(xiàn)它可以反作用于另一種調(diào)節(jié)性RNA-微RNA。（正文）信使RNA編碼蛋白的功能可以被短的microRNA序列的結(jié)合而抑制。但microRNA誘導(dǎo)的抑制作用自身又是如何被抑制的一直不得而知。在本期中，Memczak等（333頁）以及Hansen等（384頁）描述了高度穩(wěn)定的環(huán)狀RNA通過結(jié)合幾個(gè)拷貝的microRNA而終止microRNA抑制mRNA作用的過程。報(bào)道的環(huán)狀RNA（circRNA）有被Memczak稱為CDR1as以及被Hanse稱為ciRS-7的，包含可以與microRNA-7（miR-7）結(jié)合的大約70個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的高度保守序列，并可以與AGO蛋白形成復(fù)合物。后一個(gè)環(huán)狀RNA是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物的一部分，這個(gè)復(fù)合物使miRNA可以識(shí)別其目標(biāo)mRNA。當(dāng)Memczak與同事將人的CDR1as/ciRS-7表達(dá)在斑馬魚的胚胎中時(shí)，其效果與減少miR-7的表達(dá)時(shí)見到的一樣-破壞了中腦的發(fā)育。還有，作者的生物信息預(yù)測指出在基因組中有幾千個(gè)環(huán)狀RNA的存在，這與之前的報(bào)道相一致。miRNA所進(jìn)行的目標(biāo)抑制是一個(gè)有微妙之處的過程。一方面，miRNA上的這些序列可以誘導(dǎo)AGO-介導(dǎo)，通過mRNA與miRNA之間序列互補(bǔ)性激活的，在mRNA第10,11位核苷酸上的內(nèi)切性核酸酶對mRNA的切割。在目標(biāo)mRNA被切割后，miRNA被釋放，重新以催化方式去與下一個(gè)目標(biāo)結(jié)合。另一方面，miRNA可以通過化學(xué)計(jì)量的方式與目標(biāo)mRNA結(jié)合得更緊密，這樣miRNA就可以抑制蛋白的翻譯。這種方式使目標(biāo)mRNA變成了一個(gè)儲(chǔ)存miRNA的“水庫”，阻止miRNA進(jìn)一步抑制其他mRNA。后一種機(jī)理說明了競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）的作用方式。競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）是一些mRNA，它們與其他mRNA一起分享miRNA-應(yīng)答組份（MREs），因此與其它mRNA競爭性地與miRNA結(jié)合。象內(nèi)源性RNA一樣，環(huán)狀RNA也可以起miRNA水庫的作用。然而由于環(huán)狀RNA對于特異miRNA具有很多結(jié)合位點(diǎn)，因此其作用完全是為miRNA提供庇護(hù)所。內(nèi)源性RNA與miRNA的結(jié)合不僅阻止了miRNA與其他MREs的結(jié)合，同時(shí)也可以抑制內(nèi)援性RNA編碼部分的翻譯。這樣，與環(huán)狀RNA相比，內(nèi)源性RNA以相對復(fù)雜的相互作用分子的方式限制翻譯的進(jìn)行。在特殊分子中也存在其他位點(diǎn)的水庫。這些包括目標(biāo)模擬物比如在植物擬南芥中的基因IPS1對于假基因PTENP1的誘餌作用，還有可能是與其相關(guān)蛋白編碼序列分開的3’端mRNA未翻譯區(qū)。環(huán)狀RNA通過消除RNA外切酶的活性來增加自身的穩(wěn)定性，通常RNA外切酶在RNA分子自由3’或5’端開始進(jìn)行切割。還有，由于一個(gè)環(huán)狀RNA上有幾個(gè)作為拮抗單一miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，因此一個(gè)環(huán)狀RNA就可以一下子從不同目標(biāo)上抓到許多miRNA。同樣，環(huán)狀RNA的解體也可以一下子釋放出很多miRNA，而這些miRNA會(huì)去尋找具有共同MRE的mRNA作為目標(biāo)。事實(shí)上，Hansen等大致畫出了環(huán)狀RNA解體的機(jī)理，miR-671與互補(bǔ)性更強(qiáng)的CDR1as/ciRS-7結(jié)合而不是miR-7，導(dǎo)致AGO-介導(dǎo)對這一環(huán)狀RNA的切割。對miRNA進(jìn)行快照法資料分析發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)在發(fā)育，細(xì)胞分化或腫瘤形成的過渡點(diǎn)時(shí)期發(fā)生很大的變化。在這些過渡點(diǎn)階段，可以通過環(huán)狀RNA的方式清除mRNA-miRNA復(fù)合物而用另一種不同的miRNA代替。比如，作為一種蠻不講理的方法來清除miRNA時(shí)，當(dāng)細(xì)胞從干細(xì)胞開始進(jìn)行分化時(shí)環(huán)狀RNA增加表達(dá)，這樣可以捕獲在干細(xì)胞中過量表達(dá)的miRNA。環(huán)狀RNA也可以清除成熟miRNA的另一條鏈，那條鏈可能以令人驚奇的數(shù)量存在；或者環(huán)狀RNA可能具有治療的功能，將癌癥相關(guān)的miRNA從促進(jìn)癌癥形成的途徑上移除。然而在所有這些情況中，環(huán)狀RNA捕獲miRNA，但miRNA是如何被解離得仍不得而知。為了以最佳方式運(yùn)轉(zhuǎn)，每個(gè)環(huán)狀RNA上大量的miRNA結(jié)合位點(diǎn)也許是在進(jìn)化選擇的壓力下為了從其目標(biāo)位點(diǎn)上進(jìn)攻幾乎所有某種特異的miRNA。如果情況真的如此，那么一個(gè)細(xì)胞中某種環(huán)狀RNA上miRNA結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量與這種環(huán)狀RNA的拷貝數(shù)的乘積將告訴我們某一個(gè)特異性miRNAMRE的總強(qiáng)調(diào)。許多miRNA在每個(gè)細(xì)胞中大約的拷貝數(shù)是103-大致上是將其完全清除所需環(huán)狀RNA位點(diǎn)數(shù)的下界。然而，如果環(huán)狀RNA要在與mRNA競爭miRNA的結(jié)合中取得勝利，它們就需要有比mRNA更強(qiáng)的與miRNA的親和力。高親和力可以通過熱動(dòng)力學(xué)的方式建立在環(huán)狀RNA序列中，但還需要細(xì)胞中與其它相關(guān)性MREs總量相關(guān)的過量的環(huán)狀RNA編碼的miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。確實(shí)，模型制作者將很快在這個(gè)領(lǐng)域中到處可見。維護(hù)大致21個(gè)核苷酸長的miRNA沒有改變在經(jīng)過主要進(jìn)化包括環(huán)形RNA后（圖1）。對于每一個(gè)miRNA的選擇壓力無疑很高：一個(gè)miRNA的序列一定要自我成對形成發(fā)夾式miRNA前體；它一定要與目標(biāo)mRNA配對；它也一定要與終結(jié)或調(diào)節(jié)目標(biāo)相互結(jié)合的位點(diǎn)配對。雖然有大量的可能miRNA序列，miRNA數(shù)量上的改變很小，說明在剩余的進(jìn)化空間中革新受到限制，換句話說，miRNA達(dá)到了分子的完美。在整個(gè)動(dòng)物進(jìn)化過程中，自然采用一套相對穩(wěn)定的編碼基因，而miRNA的革新，通常來講，更離不開全新的序列的創(chuàng)造。也許發(fā)夾式miRNA前體輕而易舉地以有效調(diào)節(jié)因素的方式出現(xiàn)-而且“數(shù)字式地”適合大量的基因組非編碼序列，包括環(huán)狀RNA-這種因素可能會(huì)成為進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)者。作為補(bǔ)充說明，我們需要一個(gè)更好的環(huán)狀RNA的命名系統(tǒng)。“ciRS-7”說明它與miR-7結(jié)合，因此假設(shè)這類其他的環(huán)狀RNA也會(huì)清除地對應(yīng)一個(gè)miRNA?！癈DR1as”假設(shè)這個(gè)環(huán)狀RNA將與一個(gè)命名了的基因有某些聯(lián)系-在這種情況下，是一個(gè)小腦變性相關(guān)基因的反義序列。基因組中有幾千個(gè)這樣的環(huán)狀RNA，它們需要自己的編號(hào)系統(tǒng)，我建議把這個(gè)叫做circR-1。Figure 1 | Constraints on evolutionary change in microRNAs. MicroRNAs (miRNAs) liein a fitness valley constrained by their numerous interactions, which includethose with the hairpin structure of the precursor miRNA (pre-miRNA), the many targetmRNAs and other RNAs that terminate or modulate miRNA binding to targetsequences by competing against them. The latter category includes competingendogenous RNAs (ceRNAs), pseudogene decoys and miRNA mimics. Two studies1,2 introduce circular RNAs(circRNAs) as another constraining factor. MRE, miRNA-response element.圖1 microRNA 進(jìn)化改變的限制。miRNA處于健身谷中，被大量的相互作用限制在那里，這些限制性的相互作用包括帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體，許多目標(biāo)mRNA和其他通過競爭來終結(jié)或調(diào)節(jié)miRNA與目標(biāo)序列的結(jié)合的RNA。后面這類包括競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），假基因誘餌以及miRNA模擬物。（圖中說明的是miRNA在進(jìn)化過程中的各方面壓力，因?yàn)樵u論的文章中側(cè)重環(huán)狀RNA對miRNA的作用，因此評論直接用miRNA的進(jìn)化來說明。圖本身很漂亮，屬于比較fancy的那種。）（全文完）03212013-Circular-RNAs-are-large-class-animal-regulatory-potency.pdf(1095.39k)在線查看03212013-Circular-RNAs-are-large-class-animal-regulatory-potency-suppl.pdf(13538.46k)在線查看03212013-Circular-RNAs-are-large-class-animal-regulatory-potency-review.pdf(489.19k)在線查看