神經(jīng)損傷或退行性病變，如阿爾茨海默病、帕金森病、視網(wǎng)膜黃斑變性等等，往往會引起神經(jīng)元的丟失和神經(jīng)環(huán)路的受損。與具有強大自我再生能力的物種不同，哺乳動物成年后其中樞神經(jīng)系統(tǒng)幾乎喪失了神經(jīng)元再生的能力。因此，上述病癥會引起神經(jīng)元大量死亡，形成不可逆的嚴重的功能損傷。膠質(zhì)細胞被報道具有一定的可塑性。
近年來，對體內(nèi)的膠質(zhì)細胞進行重編程并將其轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元，已成為熱門的研究領(lǐng)域并具備了成為新型治療策略的潛力。這些膠質(zhì)細胞包括大腦中的星形膠質(zhì)細胞 （astrocytes）、小膠質(zhì)細胞（microglia），視網(wǎng)膜中的Müller膠質(zhì)細胞（Müller glia）或脊髓中的NG2膠質(zhì)細胞（NG2 glia）等。
研究人員往往運用病毒工具（例如腺相關(guān)病毒AAV或慢病毒Lentivirus）操控某一個或幾個轉(zhuǎn)化因子在膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達，誘導(dǎo)成年體內(nèi)的神經(jīng)元原位再生。這些因子往往在神經(jīng)發(fā)育過程中，對于神經(jīng)干細胞（stem cell）、祖細胞（progenitor）或前體細胞（precursor）等的分化起到關(guān)鍵性作用，某些甚至被認為是細胞命運決定因子（cell fate determinants）。
其中，神經(jīng)分化因子NeuroD1在轉(zhuǎn)分化過程的作用被廣泛研究和激烈爭論【1-3】。最早于2014年，暨南大學(xué)陳功教授教授團隊（回國前就職于美國賓夕法尼亞州立大學(xué)）就報道運用“膠質(zhì)細胞特異性”GFAP微型啟動子將NeuroD1通過病毒工具遞送到星形膠質(zhì)細胞中表達，即可在阿爾茨海默病小鼠模型的大腦內(nèi)實現(xiàn)超高效率的神經(jīng)元原位再生【4】。此后，該團隊多次運用NeuroD1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化技術(shù)，成功恢復(fù)了多種疾病中的功能缺陷，包括小鼠中風(fēng)模型【5】、亨廷頓病模型【6】、脊髓損傷模型【7】，大鼠顳葉癲癇模型【8】，甚至非人類靈長類動物缺血性中風(fēng)模型【9】。
然而，2021年的發(fā)表在Cell上的一項研究則對NeuroD1的轉(zhuǎn)分化的真實性提出了質(zhì)疑【10】。該研究中，來自德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的張春立教授團隊運用嚴格的遺傳譜系追蹤技術(shù)標(biāo)記大腦中的星形膠質(zhì)細胞，重新審視了NeuroD1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化過程。他們發(fā)現(xiàn)之前研究發(fā)現(xiàn)的“再生神經(jīng)元”并非源于星形膠質(zhì)細胞，而僅僅是由于GFAP微型啟動子引起的AAV泄漏表達而被錯誤標(biāo)記的內(nèi)源性神經(jīng)元。令人驚訝的是，當(dāng)運用GFAP微型啟動子來表達其他某些轉(zhuǎn)分化因子時，該類泄漏表達也或多或少存在，并呈現(xiàn)無規(guī)律性。
此后, 陳功團隊對于張春立團隊在該Cell論文中所使用的病毒滴度提出了質(zhì)疑, 認為造成錯誤標(biāo)記的原因在于后者使用了過高滴度的病毒（1013 GC/mL）去感染星形膠質(zhì)細胞，這會增加產(chǎn)生細胞毒性的風(fēng)險并勢必會導(dǎo)致NeuroD1在內(nèi)源神經(jīng)細胞中非特異表達【11、12】。
到目前為止，該研究領(lǐng)域內(nèi)對這一爭論還缺乏明確定論。并且，如果現(xiàn)有的膠質(zhì)細胞AAV遞送系統(tǒng)真的無法避免在內(nèi)源神經(jīng)元中的泄露表達，那么開發(fā)新型AAV體系用于高特異性感染膠質(zhì)細胞也迫在眉睫。
美國紐約西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院眼科和神經(jīng)科學(xué)系的陳波教授團隊（博士后Ye Xie和Jing Zhou為共同第一作者）在 eBioMedicine 期刊發(fā)表了題為：New AAV tools fail to detect Neurod1-mediated neuronal conversion of Müller glia and astrocytes in vivo 的研究論文。
該論文中作者使用嚴格的遺傳譜系追蹤（特異性標(biāo)記Müller膠質(zhì)細胞）， 并通過使用GFAP微型啟動子將NeuroD1、Math5、ASCL1或NeuroG2這四個被廣泛研究的轉(zhuǎn)化因子逐一遞送到成年小鼠視網(wǎng)膜的Müller膠質(zhì)細胞，針對上述爭論給予了深入的系統(tǒng)性探究。
實驗結(jié)果表明，GFAP微型啟動子介導(dǎo)的AAV泄露表達并非是由于高病毒滴度所引起的, 而是由其攜帶表達的轉(zhuǎn)化因子所決定 （與2021年Cell文章在大腦中的觀察結(jié)果相類似）；相反，使用低病毒滴度（1011-1012GC/mL）無法消除泄露表達，卻會造成感染效率的急劇下降；當(dāng)使用不同血清型的AAV通過不同注射途徑去感染Müller膠質(zhì)細胞, 也無法消除泄露表達，卻可以改變泄露表達的神經(jīng)元類型；更有意思的是，當(dāng)作者使用兩套改造過的新型AAV體系將這四個轉(zhuǎn)化因子導(dǎo)入到視網(wǎng)膜內(nèi)，則可極大程度上降低甚至消除泄露表達。
新型AAV體系的結(jié)果進一步表明，即真正實現(xiàn)在Müller膠質(zhì)細胞中高特異性的表達后，單一轉(zhuǎn)化因子如NeuroD1也無法實現(xiàn)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。最后, 當(dāng)使用新型AAV體系去測試大腦不同區(qū)域內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞時，作者同樣沒有檢測到NeuroD1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化（與2021年Cell文章的結(jié)論一致）。
值得一提的是，陳波團隊曾于2022年在 Cell 子刊 Cell Reports 上報道稱在Müller膠質(zhì)細胞中下調(diào)Ptbp1（另一個頗有爭議的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象）的表達無法實現(xiàn)轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞【13】。
該研究明確了病毒工具上的報告基因僅僅表明其當(dāng)前的表達水平，并不能簡單用作追溯細胞來源；對照報告基因如GFP、mCherry等的特異性表達并不足以說明該病毒工具會在攜帶表達其他重編程因子時也維持膠質(zhì)細胞的高特異性；使用譜系追蹤技術(shù)則是用來檢驗?zāi)z質(zhì)細胞是否真正轉(zhuǎn)分化為再生神經(jīng)元的“金標(biāo)準(zhǔn)”；而在被嚴格譜系追蹤的膠質(zhì)細胞中高效表達相關(guān)因子則是進行膠質(zhì)細胞重編程研究的關(guān)鍵。
另外，對于陳功團隊之前提出的譜系追蹤老鼠可能會阻礙Neurod1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化（相關(guān)機理不明）【12、14】，作者在文章的討論中表示，到目前為止，有多個研究團隊使用譜系追蹤技術(shù)分別在大腦【15、16】、視網(wǎng)膜【17-19】、脊髓【20】等不同區(qū)域或組織內(nèi)實現(xiàn)了膠質(zhì)細胞重編程為再生神經(jīng)元。因此譜系追蹤老鼠會阻礙轉(zhuǎn)分化的論斷是不穩(wěn)妥的。
有意思的是，陳功團隊于2022年在 Neural Regeneration Research 上曾發(fā)表研究結(jié)果稱視網(wǎng)膜內(nèi)的Müller膠質(zhì)細胞可以被NeuroD1轉(zhuǎn)化為不同類型的神經(jīng)元，包括感光細胞，水平細胞，無長突細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞【14】。
就此，作者在文章的討論中表示，陳功團隊的上述結(jié)果恰好印證了文章中圖4關(guān)于使用不同血清型AAV通過不同注射途徑會引起泄漏到不同內(nèi)源神經(jīng)元的假象。最近，NeuroD1在視網(wǎng)膜上引起的類似假象同樣被另外兩個研究團隊的結(jié)果所證實【21、22】。
此外，NeuroD1還于2019被報道可以將小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元【23】。有意思的是，同樣運用遺傳譜系追蹤技術(shù)，復(fù)旦大學(xué)的彭勃團隊于2021年在 Neuron 上發(fā)表文章表明NeuroD1不光無法誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元，反而會引起小膠質(zhì)細胞的凋亡【24】。
至此，已經(jīng)有至少三個獨立團隊對于三種不同類型的膠質(zhì)細胞 （星形膠質(zhì)細胞、Müller膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞）的研究結(jié)果表明，NeuroD1在體內(nèi)無法實現(xiàn)由膠質(zhì)細胞到神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化。之前觀察到的結(jié)果，極可能是病毒工具錯誤標(biāo)記內(nèi)源神經(jīng)元的假象
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