1.本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物來源的黃酮抗菌化合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：2.多重耐藥菌的快速傳播對(duì)全球的公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的威脅，迫切需要新型的抗菌藥物或抗菌增效劑。從歷史上看，抗生素的發(fā)現(xiàn)主要是通過篩選土壤微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。阻止致病菌生長。然而，這種方法重復(fù)率高，產(chǎn)量低，迫切需要挖掘新來源的抗菌化合物。以前從植物中發(fā)現(xiàn)小分子化合物，在不同目的的藥物開發(fā)中取得了很大的進(jìn)展。中草藥的化學(xué)多樣性展示了天然化合物用于治療感染的優(yōu)良效果，特別是使用奎寧和青蒿素治療瘧疾。由于缺乏哺乳動(dòng)物的先進(jìn)免疫系統(tǒng)，植物在進(jìn)化上優(yōu)化了特效藥物類分子，以對(duì)抗細(xì)菌疾病。然而，自抗生素黃金時(shí)代以來，傳統(tǒng)草藥中尚未開發(fā)的化學(xué)多樣性一直被忽視。
3.我們推斷植物產(chǎn)生了對(duì)抗細(xì)菌病原體的活性化合物。植物富含多種多酚黃酮，包含15碳骨架的結(jié)構(gòu)(c6-c3-c6)。黃酮類化合物廣泛存在于草藥中，在藥物、營養(yǎng)和農(nóng)業(yè)化學(xué)等方面具有多種用途。我們篩選出了很多帶有異戊烯基并具有抗菌效果的黃酮化合物，如α-倒捻子素(amg)和異補(bǔ)骨脂查爾酮(ibc)，不僅對(duì)mdr革蘭陽性病原體具有抗菌效果，而且對(duì)mdr革蘭陰性病原體或不同的革蘭氏陰性病原體具有滲透外膜的有效性。此外，進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，這種黃酮類化合物在殺菌過程中，具有獨(dú)特的作用方式。因此，植物來源的抗菌分子是一個(gè)未開發(fā)的寶庫，以發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥物，來避免抗生素耐藥性的日益普遍。綜上，黃酮抗菌化合物及抗菌藥物增效劑可為控制耐藥菌發(fā)展提供有利保障，具有較高的開發(fā)和研究價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：4.本發(fā)明的目的是提供植物來源的抗細(xì)菌制劑。
5.本發(fā)明首先提供了37種具有抗革蘭氏陽性耐藥菌黃酮類化合物，此外本研究還提供了31種具有聯(lián)合colistin對(duì)抗mcr陽性的革蘭氏陰性耐藥菌。a)黃酮類化合物的母環(huán)結(jié)構(gòu)：下面結(jié)構(gòu)式中所示是黃酮類化合物的母環(huán)結(jié)構(gòu)：即具有c6-c3-c6為基本骨架的一系列化合物。在黃酮母環(huán)結(jié)構(gòu)上，c3位，c6位，c8位，c3'以及c5'更易被異戊烯基取代；
6.7.所述黃酮抗菌化合物的構(gòu)效關(guān)系屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；主要包括異戊烯基的有無，數(shù)量，位置對(duì)革蘭氏陽性菌抗菌活性的影響，其次還包括其他取代基和修飾包括環(huán)化，羥基和甲氧基可能對(duì)異戊烯基化黃酮類化合物抗菌活性的影響。
8.所述黃酮抗菌化合物的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述化合物的應(yīng)用可為b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)或b8)： b1)抑制細(xì)菌；b2)制備抗細(xì)菌制劑；b3)預(yù)防細(xì)菌感染引起的疾?。?b4)制備用于預(yù)防細(xì)菌感染引起的疾病的產(chǎn)品；b5)治療細(xì)菌感染引起的疾??；b6)制備用于治療細(xì)菌感染引起的疾病的產(chǎn)品；b7)防止食物腐??；b8)制備用于防止食物腐敗的產(chǎn)品。
9.所述黃酮化合物聯(lián)合多粘菌素的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述黃酮化合物聯(lián)合多粘菌素的應(yīng)用可為c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)：c1)抑制細(xì)菌；c2)制備抗細(xì)菌制劑；c3)預(yù)防細(xì)菌感染引起的疾?。籧4)制備用于預(yù)防細(xì)菌感染引起的疾病的產(chǎn)品；c5)治療細(xì)菌感染引起的疾病；c6)制備用于治療細(xì)菌感染引起的疾病的產(chǎn)品。
10.上述任一所述細(xì)菌感染引起的疾病具體可為mrsa引發(fā)的皮膚組織感染以及vre腸道定殖。
11.上述任一所述產(chǎn)品可為藥物或疫苗。
12.本發(fā)明還保護(hù)所述黃酮化合物在恢復(fù)耐多粘菌素的革蘭氏陰性菌對(duì)多粘菌素的敏感性中的應(yīng)用。
13.上述應(yīng)用中，所述革蘭氏陰性菌多種革蘭氏陰性菌。所述耐多粘菌素的革蘭氏陰性菌具體可為含mcr耐藥基因的革蘭氏陰性菌。所述含 mcr耐藥基因的革蘭氏陰性菌具體可為含mcr-1耐藥基因的大腸桿菌、含耐藥基因的肺炎克雷伯菌、含mcr-1耐藥基因的鮑氏不動(dòng)桿菌、含mcr-1耐藥基因的弗氏枸櫞酸桿菌、含mcr-1耐藥基因的解鳥氨酸烏拉爾菌、含mcr-1耐藥基因的粘質(zhì)沙雷氏菌、含mcr-1耐藥基因的沙門氏菌、含mcr-3耐藥基因的維氏氣單胞菌、含mcr-1耐藥基因的產(chǎn)堿普羅威登斯菌、含mcr-1耐藥基因的植生烏拉爾菌或含mcr-1耐藥基因的陰溝腸桿菌。所述含mcr-1耐藥基因的大腸桿菌具體可為大腸桿菌(escherichiacoli)12120478(mcr-1)、大腸桿菌(escherichiacoli)1794 (mcr-1)、大腸桿菌(escherichiacoli)wz3909(mcr-1)、大腸桿菌(escherichiacoli)878(mcr-1)、大腸桿菌(escherichiacoli)c3(mcr-1)或大腸桿菌(escherichia coli)b2(ndm-5+mcr-1)。所述的含耐藥基因的肺炎克雷伯菌具體可為肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)38 或肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)40。所述含mcr-1耐藥基因的鮑氏不動(dòng)桿菌具體可為鮑氏不動(dòng)桿菌(acinetobacterbaumannii)17qd (mcr-1)。所述含mcr-1耐藥基因的弗氏枸櫞酸桿菌具體可為弗氏枸櫞酸桿菌(citrobacterfreumdii)2ap4rc(mcr-1)。所述含mcr-1耐藥基因的解鳥氨酸烏拉爾菌具體可為解鳥氨酸烏拉爾菌(raoultellaornithinolytica)68bc(mcr-1)。所述含mcr-1耐藥基因的粘質(zhì)沙雷氏菌具體可為粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescens)99rc(mcr-1)。所述含mcr-1耐藥基因的沙門氏菌具體可為沙門氏菌(salmonellaenterica)sh30(mcr-1)或沙門氏菌(salmonellaenterica) sh170(mcr-1)。所述含mcr-3耐藥基因的維氏氣單胞菌具體可為維氏氣單胞菌(aeromonas veronii)172(mcr-3)。所述含mcr-1耐藥基因的產(chǎn)堿普羅威登斯菌具體可為產(chǎn)堿普羅威登斯菌(providenciaalcalifaciens)slrd1wc(mcr-1)。所述含mcr-1耐藥基因的植生烏拉爾菌具體可為植生烏拉爾菌(raoultellaplanticola) drrf15bc(mcr-1)。所述含mcr-1耐藥基因
的陰溝腸桿菌具體可為陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)zwrf15bc(mcr-1)。
14.本發(fā)明還保護(hù)兩種抗菌效果很好的抗細(xì)菌制劑，其包含黃酮抗菌化合物amg和ibc。
15.實(shí)驗(yàn)證明，植物來源的抗菌分子是一個(gè)未開發(fā)的寶庫，以發(fā)現(xiàn)針對(duì) mdr病原菌的化合物，本研究首先提供了37種具有抗革蘭氏陽性耐藥菌黃酮類化合物，此外本研究還提供了31種具有聯(lián)合colistin對(duì)抗mcr 陽性的革蘭氏陰性耐藥菌。在結(jié)構(gòu)上，異戊烯基的位置和數(shù)量對(duì)抗菌活性起著至關(guān)重要的作用。另外，其他取代基和修飾包括環(huán)化，羥基和甲氧基也可能對(duì)異戊烯基化黃酮類化合物的抗菌活性產(chǎn)生重要影響。本研究以化合物amg或ibc作為異戊烯基化黃酮類化合物的代表，研究發(fā)現(xiàn)此化合物不具有溶血性和細(xì)胞毒性，具備較好的安全性；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，黃酮類化合物amg或ibc可以有效的抑制mdr革蘭氏陽性菌引發(fā)的感染或污染，包括治療由mrsa引起的傷口皮膚感染，清除vre 的腸道定殖以及較好的防腐敗和消毒作用。此外，黃酮化合物amg或 ibc來源于植物，分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，可大量獲取和制備。因此，本發(fā)明具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
附圖說明
16.圖1為黃酮抗菌化合物amg和ibc與不同種類抗生素的協(xié)同效果。
17.圖2為黃酮抗菌化合物amg和ibc的溶血性試驗(yàn)。
18.圖3為黃酮抗菌化合物amg和ibc治療小鼠傷口的皮膚感染；其中pbs為pbs組，ibc為ibc治療組，amg為amg治療組，抗生素組為萬古霉素治療組。
19.圖4為黃酮抗菌化合物amg或ibc可以有效清除vre腸道定殖；其中pbs為pbs組，ibc為ibc治療組，amg為amg治療組，抗生素組為泰妙菌素治療組。
20.圖5為黃酮抗菌化合物amg或ibc防腐敗模型；
21.圖6為黃酮抗菌化合物amg或ibc消毒模型。
實(shí)施例
22.下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例所述方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明制備方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
23.balb/c雌性小鼠為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
24.mhb肉湯培養(yǎng)基為含牛肉粉1.5g/l、可溶性淀粉1.5g/l和酸水解酪蛋白17.5g/l的水溶液。
25.實(shí)施例1、植物來源的黃酮抗菌化合物的篩選
26.據(jù)估計(jì)，植物界現(xiàn)存大約有450000個(gè)物種，在《中國植物志》記載了中國的301科3408屬31142種維管植物。黃酮類化合物廣泛分布于植物中，履行許多功能。目前，超過5000個(gè)自然的黃酮類化合物已從各種植物中被鑒定。本發(fā)明首先從文獻(xiàn)中查找了85個(gè)黃酮類化合物，包括23個(gè)黃酮，20個(gè)異黃酮，13個(gè)黃烷酮，10個(gè)查爾酮以及19個(gè)酮。在結(jié)構(gòu)上，以含有異戊烯基基團(tuán)為主。據(jù)統(tǒng)計(jì)，這些化合物來自于 39個(gè)科，271株不同的植物。根據(jù)clsi 2019標(biāo)準(zhǔn)指南(抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn))測(cè)定了其對(duì)細(xì)菌病原體的抗菌活性，并評(píng)價(jià)黃酮化合物的抗菌效果及其與多種抗菌藥物(如β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四
環(huán)素類、糖肽類、喹諾酮類、氯霉素類及利福霉素類)的協(xié)同抗菌作用。
27.方法1：采用肉湯稀釋法(clinical and laboratory standards institute， clsi，2019)檢測(cè)85種黃酮化合物的抗菌活性，測(cè)試菌株為金黃色葡萄球菌atcc 29213和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)。檢測(cè)85 種黃酮化合物對(duì)mrsa菌株的最小抑菌濃度的步驟如下：
28.1、用mhb肉湯培養(yǎng)基懸浮待測(cè)菌株，得到菌濃度為1
×
108cfu/ml 的菌懸液。
29.2、取85種黃酮化合物其中一種，用dmso溶解并用mhb肉湯培養(yǎng)基稀釋，得到濃度為512μg/ml的化合物溶液。
30.3、取96孔板，加入mhb肉湯培養(yǎng)基(每孔100μl)，第一列每孔加入步驟2制備的化合物溶液(每孔100μl)，倍比稀釋至第十孔，第十孔棄掉100μl液體，之后每孔加入100μl步驟1制備的菌懸液，最終化合物溶液在孔中的濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、 32.0μg/ml、64.0μg/ml或128.0μg/ml，37℃靜置培養(yǎng)16h-20h，觀察孔內(nèi)抑制細(xì)菌生長的最低濃度即為mic。在96孔板中設(shè)置陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔。每個(gè)陰性對(duì)照孔加入200μlmhb肉湯培養(yǎng)基。每個(gè)陽性對(duì)照孔加入100μlmhb肉湯培養(yǎng)基和100μl步驟1制備的菌懸液。
31.方法2：采用棋盤分析法檢測(cè)85種黃酮化合物與不同抗菌藥物的協(xié)同作用，測(cè)試菌株為大腸桿菌atcc 25922和多重耐藥的大腸桿菌(escherichia coli)b2(ndm-5+mcr-1)，棋盤分析法具體步驟如下：
32.1)用mhb肉湯培養(yǎng)基懸浮測(cè)試菌株，得到菌濃度為1
×
108cfu/ml 的菌懸液。
33.2)取85種黃酮化合物其中一種，用dmso溶解并用mhb肉湯培養(yǎng)基稀釋，得到濃度為256μg/ml的黃酮化合物溶液。
34.3)取抗菌藥物(氨芐西林；頭孢曲松；紅霉素；氟苯尼考；慶大霉素；美羅培南；氧氟沙星；多粘菌素；利福平；四環(huán)素；氟苯尼考)，用dmso溶解并用mhb肉湯培養(yǎng)基稀釋，得到濃度為128μg/ml的抗菌藥物溶液。
35.4)取96孔板，每孔加入100μlmhb肉湯培養(yǎng)基，最后一行每孔加入100μl步驟2)制備的黃酮化合物溶液(第一孔濃度為512μg/ml)，自第八行倍比稀釋至第二行；第一列每孔加入加入步驟3)制備的抗菌藥物溶液(每孔100μl)，倍比稀釋至第十列，之后每孔加入100μl步驟1)制備的菌懸液，37℃靜置培養(yǎng)16h-20h，觀察黃酮化合物與不同抗菌藥物聯(lián)合使用抑制細(xì)菌生長時(shí)二者的最低濃度組合。設(shè)置陽性對(duì)照孔，每個(gè)陽性對(duì)照孔加入100μlmhb肉湯培養(yǎng)基和100μl步驟1)制備的菌懸液。
36.分級(jí)抑菌濃度fic指數(shù)按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：
37.fic＝mic(a聯(lián)合應(yīng)用)/mic(a單用)+mic(b聯(lián)合應(yīng)用)/mic(b單用)
38.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，結(jié)果表明，將近一半的黃酮類化合物(37/85)對(duì)藥物敏感的金黃色葡萄球菌atcc 29213和耐藥mrsa t144(1-8μg/ ml)均具有強(qiáng)大的抗菌活性。需要強(qiáng)調(diào)的是，盡管所有的黃酮類化合物對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌均無抗菌作用，但黃酮中的三分之一(31/85)可恢復(fù)帶有mcr耐藥基因e.coli b2對(duì)抗生素colistin的敏感性。
39.表1
40.41.[0042][0043]
a表示在8μg/ml黃酮化合物作用下，抑制e.coli b2生長時(shí)，所需要colistin的最低濃度(μg/ml)；b表示colistin和黃酮化合物(8μg/ml)聯(lián)合抑制e.coli b2生長時(shí)的fici被展示出來。
[0044]
實(shí)施例2、植物來源的黃酮抗菌化合物的篩選
[0045]
在大多數(shù)黃酮類化合物中，都可以檢測(cè)到異戊烯化。文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮類化合物發(fā)揮抗菌活性，與異戊烯基有關(guān)。在本研究中，通過構(gòu)效關(guān)系的比較，我們發(fā)現(xiàn)異戊烯基是黃酮類化合物發(fā)揮抗菌活性必不可少的基團(tuán)，但并非所有異戊烯基化的類黃酮都具有抗菌活性。在85個(gè)化合物中，有79個(gè)化合物具有異戊烯基基團(tuán)，其中有46個(gè)化合物具有一個(gè)異戊烯基，有25個(gè)具有兩個(gè)異戊烯基，有8個(gè)具有三個(gè)異戊烯基。然而，在85個(gè)化合物中，有37個(gè)化合物對(duì)mrsa具有抗菌活性，其中有36個(gè)化合物異戊烯化，有1個(gè)化合物未異戊烯化。其中，與一個(gè)或三個(gè)異戊烯化的化合物相比較，有兩個(gè)異戊烯化(69.2％，18/26)的黃酮抗菌化合物占優(yōu)勢(shì)。并且，異戊烯基位于黃酮化合物骨架的c8(44.4％， 16/36)、c6(30.6％，11/36)、c3(22.2％，8/36)和c3’(16.7％，6/36)是其抗菌活性的先決條件，這與前人的研究結(jié)果一致。異戊烯基的存在增加了黃酮化合物的疏水性，這導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌生物膜的親和力更高，并與靶蛋白的相互作用更好，這是目前大家公認(rèn)的對(duì)抗菌作用的解釋。此外，異戊烯基在特定骨架中的位置和數(shù)量在抗菌活性中也起著重要作用。在本研究所測(cè)試的所有黃酮化合物中，活性較好的候選物都有兩個(gè)異戊烯基。另外，其他取代基和修飾包括環(huán)化，羥基和甲氧基也可能對(duì)異戊烯基化黃酮類化合物的抗菌活性產(chǎn)生重要影響。
[0046]
實(shí)施例3、黃酮化合物amg，ibc抗菌活性的測(cè)定
[0047]
本研究為了更好地發(fā)現(xiàn)效果最佳的先導(dǎo)化合物，從5大類黃酮中分別篩選出桑黃酮，5,7,4'-三羥基-6,3'-二異戊烯基異黃酮，光甘草醇，異補(bǔ)骨脂查爾酮(ibc)andα-倒捻子素(amg)。由于發(fā)現(xiàn)amg和ibc 不僅具有較好的抗革蘭氏陽性菌的活性和協(xié)同colistin抗革蘭氏陰性菌的活性，而且具有較低的溶血性和細(xì)胞毒性，因此針對(duì)amg和ibc做了更進(jìn)一步的抗菌活性測(cè)定。
[0048]
本部分主要測(cè)定了amg和ibc對(duì)mdr細(xì)菌mrsa(23株)和 vre(54株)的抗菌活性。其中還包括質(zhì)控菌株atcc 29213，atcc 25922以及對(duì)照菌株e.coli b2。
[0049]
待測(cè)菌株詳見表2。
[0050]
表2
[0051]
[0052]
[0053][0054][0055]
注：a、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc no.29213和大腸桿菌
(escherichiacoli)atcc no.25922均保藏于美國模式培養(yǎng)物集存庫(簡稱atcc，地址：american type culture collection(atcc)10801university boulevardmanassas,va 20110usa)，公眾可從美國模式培養(yǎng)物集存庫獲得。
[0056]
b、糞腸球菌(enterococcus faecalis)vre a4為萬古霉素的耐藥菌株。金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)mrsa t144為甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌。名稱中含有“ndm”的菌株均為產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的菌株。名稱中含有“mcr”的菌株均為攜帶有多粘菌素耐藥基因mcr的菌株。
[0057]
c、文獻(xiàn)1為liu y，ding s，dietrich r，e，zhu k.a biosurfactant inspiredheptapeptide with improved specificity to kill mrsa[j].angewandte chemieinternational edition，2017，56(6)，1486-1490.糞腸球菌(enterococcus faecalis)vrea4和金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)mrsa t144，在文獻(xiàn)1中的名稱依次為enterococcus faecalis vre a4和mrsa t144。
[0058]
d、文獻(xiàn)3為ling z，yin w，li h，et al.chromosome-mediated mcr-3variants inaeromonas veronii from chicken meat[j].antimicrobial agents and chemotherapy，2017， 61(11)：e01272-17.維氏氣單胞菌(aeromonas veronii)172(mcr-3)在文獻(xiàn)3中的名稱為aeromonas veronii 172。
[0059]
e、來源中為自行分離的菌株的分離過程如下：(1)分別采集山東、河南、四川等省份的距離較遠(yuǎn)的不同屠宰場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)豬鼻拭子，超市內(nèi)零售雞肉、豬肉等，將其浸漬于bhi液體培養(yǎng)基中5min，并將其過濾，濾液保存于eswab管中備用；(2)用接種環(huán)蘸取不同濾液涂布于含2μg/ml的多粘菌素的科馬嘉尿道定位顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h，挑選紅色(大腸桿菌)、藍(lán)色(肺炎克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬)或奶油色半透明(假單胞桿菌屬)的單克隆菌株轉(zhuǎn)接到bhi平板上，37℃培養(yǎng)18h。用超厚濾紙片從平板上刮取適當(dāng)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到2ml無菌試管中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?3)挑選單克隆菌株接種于bhi液體培養(yǎng)基中增菌，然后提取基因組dna；(4)以步驟(3)提取的基因組dna為模板，采用常規(guī)pcr 擴(kuò)增16srrna和測(cè)序的方法進(jìn)一步確證菌屬；同時(shí)，擴(kuò)增mcr基因檢測(cè)。
[0060]
采用肉湯稀釋法(clinical and laboratory standards institute，clsi， 2019)檢測(cè)amg或ibc黃酮化合物的抗菌活性。檢測(cè)對(duì)各待測(cè)菌株的最小抑菌濃度，步驟同實(shí)施例1的方法1：
[0061]
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，化合物amg或ibc對(duì)革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌、糞腸球菌)具有良好的抗菌活性，而對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)無抗菌活性?；衔颽mg或ibc對(duì)革蘭氏陽性菌(含耐藥菌)的最小抑菌濃度分別為0.5-1μg/ml、4-8μg/ml。
[0062]
表3
[0063][0064]
mrsa,耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌；vre,耐萬古霉素的腸球菌；amg:α-倒捻子素；ibc: 異補(bǔ)骨脂查耳酮；van:萬古霉素.e.coli b2,攜帶有多種抗生素耐藥基因的臨床分離株，包括 bla
ndm-5
,bla
tem-1b
,mcr-1,tet(a),mdfa,arr-2,aph(4)和fosa3.
[0065]
實(shí)施例4、黃酮抗菌化合物amg或ibc和抗菌藥物的協(xié)同作用
[0066]
四環(huán)素、替加環(huán)素屬于四環(huán)素類藥物。氟苯尼考屬于氯霉素類藥物。氨芐西林、頭孢曲松、美羅培南屬于β-內(nèi)酰胺類藥物。紅霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類藥物。慶大霉素屬于氨基糖苷類化合物。氧氟沙星屬于喹諾酮類藥物。多粘菌素屬于環(huán)肽類藥物。利福平屬于利福霉素類藥物。
[0067]
一、黃酮抗菌化合物amg或ibc和不同抗生素的協(xié)同作用
[0068]
首先，為了確定化合物amg和ibc對(duì)不同類別的抗生素是否具有增強(qiáng)作用，因此，多藥耐藥菌e.coli b2作為模式菌株，針對(duì)包括抑制蛋白質(zhì)合成的四環(huán)素，阻止dna復(fù)制的氧氟沙星(喹諾酮類抗生素)，抑制rna合成的利福平和氨芐西林(一種β-內(nèi)酰胺抗生素)等抗生素進(jìn)行測(cè)定。其次，為了驗(yàn)證協(xié)同抗菌效果，我們進(jìn)一步評(píng)估了對(duì)87種耐藥的臨床大腸桿菌分離株的協(xié)同效果，其中77株來源于人的分離株和10株來自動(dòng)物的分離株。為了進(jìn)一步研究這種組合針對(duì)不同細(xì)菌的普遍性，我們隨后測(cè)定了11種革蘭氏陰性細(xì)菌的fic值，這些所測(cè)試的革蘭氏陰性菌幾乎都存在mcr基因。
[0069]
抗菌藥物為四環(huán)素、替加環(huán)素、氟苯尼考、氨芐西林、頭孢曲松、美羅培南、紅霉素、慶大霉素、氧氟沙星、多粘菌素、利福平。
[0070]
采用棋盤分析法檢測(cè)化合物amg或ibc與不同抗菌藥物的協(xié)同作用，測(cè)試菌株為大腸桿菌(escherichia coli)b2(ndm-5+mcr-1)，棋盤分析法具體步驟同實(shí)施例1的方法2。
[0071]
測(cè)試結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，化合物amg或ibc和所測(cè)試抗菌藥物(四環(huán)素、替加環(huán)素、氟苯尼考、氨芐西林、頭孢曲松、美羅培南、紅霉素、慶大霉素、氧氟沙星和利福平)的fic指數(shù)均大于0.5，但協(xié)同多粘菌素的fic指數(shù)0.04，因此化合物amg或ibc和多粘菌素具有良好的協(xié)同作用。
[0072]
二、黃酮抗菌化合物amg或ibc恢復(fù)多粘菌素耐藥的革蘭氏陰性菌對(duì)多粘菌素的敏感性
[0073]
采用棋盤分析法測(cè)定化合物amg或ibc和抗菌藥物對(duì)mcr陽性革蘭氏陰性菌的協(xié)同作用，具體實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1的方法2。
[0074]
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，化合物amg或ibc聯(lián)合多粘菌素對(duì)藥物敏感或耐藥的革蘭氏陰性菌的fic指數(shù)為0.03-0.26，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.5。因此化合物amg或ibc可恢復(fù)耐多粘菌素的革蘭氏陰性菌對(duì)多粘菌素的敏感性。
[0075]
表4
[0076][0077]
實(shí)施例5、黃酮抗菌化合物amg或ibc的溶血性試驗(yàn)
[0078]
pbs緩沖液為ph7.4、0.01m的pbs緩沖液。
[0079]
8％紅細(xì)胞懸浮液的制備方法如下：(1)取脫纖維羊血10ml，3000g 離心10min，棄上清，得到沉淀；(2)取步驟(1)得到的沉淀，用pbs 緩沖液清洗兩次，得到100％紅細(xì)胞懸浮液；(3)將8ml 100％紅細(xì)胞懸浮液和92ml pbs緩沖液混合，得到8％紅細(xì)胞懸浮液。
[0080]
取化合物amg或ibc，用dmso溶解，然后用pbs緩沖液稀釋，得到濃度為1024μg/ml的化合物amg或ibc溶液。
[0081]
1、在96孔板中前11列加入100ul/孔的pbs溶液，最后一列加入 100ul 0.2％
tritonx-100作為陽性對(duì)照。
[0082]
2、完成步驟1后，取所述96孔板，第一孔加入100μl化合物amg或ibc溶液，依次倍比稀釋至第10列；第11列作為陰性對(duì)照。第一孔至第十孔濃度分別為：512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml。
[0083]
3、完成步驟2后，取所述96孔板，每孔加入100μl8％紅細(xì)胞懸浮液，37℃孵育1h，3000g離心10min，吸取100μl上清液至新的1.5ml離心管中。
[0084]
4、多功能酶標(biāo)儀測(cè)量步驟3得到的上清液的od
576nm
值，即化合物amg或ibc溶液od
576nm
值。
[0085]
5、將步驟2替換為步驟a，其它步驟均不變，得到陰性對(duì)照od
576nm
值。步驟a為：取所述96孔板，每孔加入100μlpbs緩沖液。
[0086]
6、將步驟2替換為步驟b，其它步驟均不變，得到陽性對(duì)照od
576nm
值。步驟b為：取所述96孔板，每孔加入100μltritonx-100。
[0087]
根據(jù)下述公式計(jì)算溶血率和半數(shù)溶血濃度hly
50
：
[0088]
溶血率＝(化合物amg或ibc溶液od576
nm
值-陰性對(duì)照od
576nm
值)/(陽性對(duì)照od
576nm
值-陰性對(duì)照od
576nm
值)
×
100％。
[0089]
部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，化合物amg和ibc的hly
50
分別為41.89μg/ml和391.1μg/ml，治療指數(shù)分別為83.78和97.78，因此兩個(gè)化合物均具有較安全的治療指數(shù)。
[0090]
實(shí)施例6、化合物amg或ibc治療小鼠皮膚感染
[0091]
1、實(shí)驗(yàn)操作具體步驟
[0092]
(1)小鼠稱重分組，每組10只小鼠；
[0093]
(2)balb/c小鼠1％戊巴比妥鈉，100ul腹腔注射麻醉，背部剃毛，剃干凈。
[0094]
(3)用鉛筆畫一個(gè)直徑為0.5cm的圓形；一只鼠背部2個(gè)傷口重復(fù)；當(dāng)傷口附近毛發(fā)長出及時(shí)清理，保證傷口周圍干凈無毛發(fā)。
[0095]
(4)在傷口處滴上50ul的mrsa，菌濃度為2
×
108cfu/ml。最終滴到傷口處的菌量為1
×
107cfu。
[0096]
(5)攻菌處理后1h，分別用10％dmso，2mg/kgamg，8mg/kgibc，van1mg/kg(每組滴50ul進(jìn)行治療)
[0097]
(6)感染一天后傷口化膿為造模成功；
[0098]
(7)感染后第3，5，7，10，15天拍照，取傷口處皮膚(每次取四只鼠，四個(gè)傷口)，研磨，菌落計(jì)數(shù)。
[0099]
2、統(tǒng)計(jì)感染后第3，5，7，10，15天傷口尺寸，并進(jìn)行傷口處菌落計(jì)數(shù)。
[0100]
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，amg和ibc可以促進(jìn)mrsa引起的皮膚傷口愈合，對(duì)小鼠皮膚感染模型具有治療效果，在體內(nèi)的抗菌作用與萬古霉素相似。
[0101]
實(shí)施例7、化合物amg或ibc可以有效清除vre腸道定殖
[0102]
分組：pbs組；amg(1，4mg/kg)治療組；ibc(16，64mg/kg)治療組；對(duì)照泰妙菌素(2mg/kg)治療組。
[0103]
1、實(shí)驗(yàn)操作具體步驟
[0104]
(1)0.5g/lamp飲水處理五天之后；停藥一天；取糞便，進(jìn)行稱重及vre計(jì)數(shù)(cfu/g)；
[0105]
(2)1
×
109cfus vre灌胃一次，每只小鼠灌胃200ul菌液；24h 后(即給藥治療前前)，取糞便，稱重及測(cè)vre數(shù)目(cfu/g)。每組取 3只，取糞便和腸段送公司測(cè)菌群豐富度；
[0106]
(3)vre灌胃24h后，進(jìn)行灌胃給藥治療(200ul)，6組小鼠分別給予pbs，amg(1和4mg/kg)，ibc(16和64mg/kg)和泰妙菌素(2mg/kg)。
[0107]
(4)每天固定時(shí)間，取糞便，稱重及測(cè)vre數(shù)目，共檢測(cè)7天。給藥治療后1天和7天取回腸、盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物計(jì)數(shù)，且取部分各腸段分別用4％多聚甲醛固定及-80℃凍存(備注：給藥第一天解剖一半的小鼠，取腸段；給藥第七天再解剖剩下的那一半小鼠，取腸段)。
[0108]
(5)將治療前采集的糞便、治療后1，3，7天的糞便和給藥治療后1天和7天腸段送賽諾百合公司，進(jìn)行16s宏基因組測(cè)序，測(cè)腸道菌群相對(duì)豐度以及腸道菌群多樣性(備注：糞便或者內(nèi)容物可以多采集一點(diǎn)，例如每只小鼠采集三到四顆糞便，腸段內(nèi)容物盡可能多采集)。
[0109]
2、試驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備
[0110]
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡icr小鼠。本實(shí)驗(yàn)均用無菌水，正常鼠糧。試驗(yàn)共分為6組，每組8只小鼠，正式實(shí)驗(yàn)需要48只小鼠。
[0111]
3、實(shí)驗(yàn)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)
[0112]
治療前采集的糞便、治療后1，3，7天的糞便和給藥治療后1天和 7天腸段送賽諾百合公司，進(jìn)行16s宏基因組測(cè)序。
[0113]
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由于amg或ibc口服給藥導(dǎo)致腸道內(nèi)定殖的vre 濃度降低。這些結(jié)果表明amg或ibc在體內(nèi)可以迅速殺死vre。
[0114]
實(shí)施例8、化合物amg或ibc防腐敗模型
[0115]
接下來，在腐敗模型中將amg和ibc用作食品防腐劑。
[0116]
1、實(shí)驗(yàn)操作具體步驟
[0117]
(1)豬肉28塊(每塊5g)，隨機(jī)分成7組；一組為陰性對(duì)照，不做處理；其余6組每組滴加200μl金黃色葡萄球菌atcc 29213 6
×?
103cfus/ml，之后分別滴加100μl不同濃度的amg或ibc，具體濃度如下：
①
0μg/ml藥物；
②
amg 2mg/kg；
③
amg 5mg/kg；
④
ibc 8mg/kg；
⑤
ibc 20mg/kg；化合物所選用的濃度分別對(duì)應(yīng)2
×
mic和5
?×
mic；
⑥
對(duì)照：山梨酸鉀(0.075g/kg)；
[0118]
(2)置于37℃培養(yǎng)箱中放置24h，觀察肉質(zhì)、形態(tài)變化和氣味；
[0119]
(3)豬肉勻漿，梯度稀釋，用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
[0120]
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，amg或ibc可以有效減少豬肉腐敗模型中金黃色葡萄球菌的數(shù)量，經(jīng)過amg或ibc處理的肉的質(zhì)量和氣味得到了很好的保留。
[0121]
實(shí)施例9、化合物amg或ibc消毒模型
[0122]
為了評(píng)估amg和ibc作為餐具消毒劑的效果，研究了amg和ibc 在裝有mrsa的午餐盒上的消毒效果。
[0123]
1、實(shí)驗(yàn)操作具體步驟
[0124]
(1)飯盒28個(gè)，隨機(jī)分成7組；一組為陰性對(duì)照，不做處理；其余6組每組飯盒底部涂抹含有金黃色葡萄球菌atcc 29213 6
×
10
6 cfus/ml的懸濁液200μl，靜置30min；
[0125]
(2)之后分別滴加500μl不同濃度的amg或ibc，具體濃度如下
①
0μg/ml藥物；
②
amg 2mg/l；
③
amg 5mg/l；
④
ibc 8mg/l；
⑤
ibc 20mg/l；化合物所選用的濃度分別對(duì)應(yīng)2
×
mic和5
×
mic；
⑥
對(duì)照：新潔爾滅(2g/l)。
[0126]
(3)室溫靜置2min后，用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
[0127]
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，amg或ibc的濃度分別為2μg/ml 和8μg/ml，可在2分鐘時(shí)顯著降低塑料午餐盒上的金黃色葡萄球菌的數(shù)量，并在10分鐘內(nèi)消除所有金黃色葡萄球菌，這與新潔爾滅的作用相似。因此，化合物amg或ibc具有較好的消毒效果。
