本文來源：類器官學(xué)社
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神經(jīng)發(fā)育障礙是一類常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中自閉癥譜系障礙是最為典型的一種。近年來，隨著單細(xì)胞技術(shù)和CRISPR技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們開始探索使用單細(xì)胞腦類器官培養(yǎng)和CRISPR技術(shù)相結(jié)合的方法，研究與自閉癥譜系障礙相關(guān)的基因突變對細(xì)胞命運(yùn)決定的影響。
今天小學(xué)社要分享的就是一項(xiàng)《Nature》上發(fā)表的最新研究，該研究通過這種方法，成功地鑒定了與自閉癥譜系障礙相關(guān)的高風(fēng)險基因，并揭示了這些基因?qū)?xì)胞命運(yùn)決定的影響。這項(xiàng)研究為在具有細(xì)胞狀態(tài)、分子通路和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)讀數(shù)的類器官模型中進(jìn)行疾病易感基因的高通量表型表征鋪平了道路。
人類大腦皮層發(fā)育涉及獨(dú)特的過程，這些過程由精確和高度協(xié)調(diào)的遺傳和分子程序控制，其中許多程序仍然難以捉摸。許多神經(jīng)發(fā)育障礙(NDD)，如自閉癥譜系障礙(ASD)，只有在出生后，大腦發(fā)育幾乎完成時才被診斷出來，在人類背景下分析與ASD相關(guān)的發(fā)育和細(xì)胞類型特異性缺陷至關(guān)重要。腦類器官為研究這些障礙提供了人類背景，但其表型變異性和低通量限制了其實(shí)用性。
本研究旨在通過使用CRISPR-人腦類器官-單細(xì)胞RNA測序（CHOOSE）系統(tǒng)，在腦類器官中篩選高風(fēng)險ASD基因，以克服這些限制。
使用CHOOSE系統(tǒng)對人類腦類器官中的ASD風(fēng)險基因進(jìn)行多重篩選。
在胚胎體中誘導(dǎo)eCas9，然后進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)。
使用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）分析突變細(xì)胞。
在類器官中鑒定多種細(xì)胞類型，包括祖細(xì)胞、興奮性神經(jīng)元、抑制性神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPC)。
RNA速度分析揭示從神經(jīng)前體細(xì)胞到神經(jīng)元群體的發(fā)育軌跡。
構(gòu)建腦類器官的發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定與ASD相關(guān)的調(diào)控模塊
1. 條形碼類器官的單細(xì)胞CRISPR篩選與選擇類器官產(chǎn)生多種細(xì)胞類型
研究人員使用表達(dá)增強(qiáng)特異性SpCas9 (eCas9)的人胚胎干細(xì)胞(hES)系進(jìn)行CRISPR干擾的類器官系統(tǒng)的構(gòu)建。該系統(tǒng)通過慢病毒載體傳遞4-羥他莫昔芬誘導(dǎo)的CRE重組酶和雙單導(dǎo)RNA (sgRNA)盒，使用基于流式細(xì)胞術(shù)的gRNA報告基因檢測來確定每個sgRNA對的編輯效率，并使用克隆條形碼監(jiān)測創(chuàng)始細(xì)胞的克隆復(fù)雜性。該系統(tǒng)具有高效、可控、克隆復(fù)雜度高的特點(diǎn)。
此外，研究人員還選取了與ASD風(fēng)險相關(guān)的36個基因進(jìn)行研究，通過基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的分析，發(fā)現(xiàn)受擾動的細(xì)胞狀態(tài)類似于未受擾動細(xì)胞狀態(tài)，同時成功鑒定了多種端腦細(xì)胞類型，揭示了從神經(jīng)祖細(xì)胞到背側(cè)和腹側(cè)端腦神經(jīng)元群的發(fā)育軌跡，還發(fā)現(xiàn)了一組表達(dá)MEIS2和高水平PAX6的中間神經(jīng)元，并對篩選的幾個ASD基因的細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式進(jìn)行了進(jìn)一步分析（圖1）。
圖1
2. 細(xì)胞增殖耗竭表型與干擾ASD基因的細(xì)胞類型特異性效應(yīng)
研究人員從scRNA-seq互補(bǔ)DNA文庫中恢復(fù)了gRNA信息，并從四個類器官池中提取了大量基因組DNA。研究發(fā)現(xiàn)，ecas9誘導(dǎo)的細(xì)胞中存在異質(zhì)gRNA的表達(dá)，通過比較ecas9誘導(dǎo)細(xì)胞和未誘導(dǎo)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)gRNA存在顯著富集和缺失，并證實(shí)了四個基因(KMT2C, LEO1, ADNP和WAC)在個體擾動類器官中的富集和消耗表現(xiàn)出最大的效應(yīng)量。此外，研究發(fā)現(xiàn)在ASD患者和腦類器官疾病模型中出現(xiàn)細(xì)胞類型特異性改變，對多個ASD基因擾動進(jìn)行系統(tǒng)評估、比較和分類，并發(fā)現(xiàn)在24次擾動中，背側(cè)與腹側(cè)細(xì)胞比例發(fā)生了顯著變化，大多數(shù)干擾導(dǎo)致背腹比降低，其中KMT2C的擾動導(dǎo)致腹側(cè)細(xì)胞的富集。對于23個擾動，至少一種細(xì)胞類型豐度發(fā)生變化，此外，六種擾動只針對一種細(xì)胞類型。在祖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)中間祖細(xì)胞（IPC）損耗在擾動中具有強(qiáng)烈的收斂效應(yīng)，在多種擾動中IPC和中間神經(jīng)元前體細(xì)胞（INP）受影響最嚴(yán)重。通過分析特定的神經(jīng)元亞群，發(fā)現(xiàn)L2/3興奮性神經(jīng)元在多數(shù)擾動中受到更大的影響和消耗。這些數(shù)據(jù)表明ASD病理可能早在神經(jīng)祖細(xì)胞階段就存在（圖2）。
圖2
3. ASD基因擾動后基因表達(dá)的改變以及ASD相關(guān)的監(jiān)管模塊
研究人員在所有擾動中檢測到2071個差異表達(dá)基因(DEG)，還在背側(cè)和腹側(cè)種群中識別出基因失調(diào)，以及在一個種群中特異性失調(diào)的基因(KMT2C, LEO1擾動)。此外，許多基因在多重?cái)_動中存在差異表達(dá)。基因本體術(shù)語富集分析表明，細(xì)胞粘附、細(xì)胞分化、前腦發(fā)育和細(xì)胞外生是最相關(guān)的生物學(xué)過程，并發(fā)現(xiàn)了許多特定于微擾的基因本體術(shù)語。這些結(jié)果說明使用CHOOSE系統(tǒng)可以檢測復(fù)雜生物表型。
此外，研究人員使用多組學(xué)數(shù)據(jù)來構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）模型，以確定與ASD相關(guān)的調(diào)控樞紐，并觀察到在背側(cè)和腹側(cè)端腦中存在特定的轉(zhuǎn)錄因子模塊，這些模塊受到ASD遺傳擾動的影響。在研究過程中，研究人員使用了Pando等算法來推斷出這些基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并檢驗(yàn)了SFARI基因庫中的基因?qū)@些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的富集度。研究結(jié)果表明，OLIG1和EOMES等關(guān)鍵因素以及與ASD相關(guān)的調(diào)控因子存在高度相關(guān)性（圖3）。
圖3
4. ARID1B干擾對v-RGCs的影響
研究人員發(fā)現(xiàn)，ARID1B的擾動導(dǎo)致了腹側(cè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（v-RGC）的顯著富集。此外，ARID1B干擾的細(xì)胞在OPC軌跡中強(qiáng)烈富集，使v-RGC向早期OPC的轉(zhuǎn)變概率明顯高于向神經(jīng)元命運(yùn)的轉(zhuǎn)變概率。
為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)是否與人類疾病相關(guān)，研究人員招募了兩名攜帶ARID1B雜合突變的患者進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組相比，這兩名患者相應(yīng)的神經(jīng)節(jié)隆起(GE)體積增大，其OLIG2+細(xì)胞比例也呈顯著上升，這些表明ARID1B的缺陷導(dǎo)致了腹側(cè)祖細(xì)胞擴(kuò)增異常和細(xì)胞命運(yùn)異常（圖4）。
圖4
本研究使用了單細(xì)胞腦類器官培養(yǎng)和CRISPR技術(shù)相結(jié)合的方法，研究了與自閉癥譜系障礙相關(guān)的基因突變對細(xì)胞命運(yùn)決定的影響。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元前體細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是最容易受到基因突變影響的細(xì)胞類型。通過構(gòu)建腦類器官的發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究團(tuán)隊(duì)為我們深入了解神經(jīng)發(fā)育障礙提供了新的思路和方法。這項(xiàng)研究為未來開發(fā)更有效的治療自閉癥譜系障礙的方法提供了重要的理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
Li C, Fleck JS, Martins-Costa C, Burkard TR, Themann J, Stuempflen M, Peer AM, Vertesy á, Littleboy JB, Esk C, Elling U, Kasprian G, Corsini NS, Treutlein B, Knoblich JA. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 2023 Sep;621(7978):373-380. doi: 10.1038/s41586-023-06473-y. Epub 2023 Sep 13. PMID: 37704762; PMCID: PMC10499611.
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