通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建基因敲除、點(diǎn)突變和敲入誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs) ，可為多種疾病的發(fā)生和治療提供有效的研究模型。那IPS細(xì)胞的基因編輯有哪些應(yīng)用范圍呢？如何應(yīng)用基因敲除的IPS細(xì)胞開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)?？讓我們一起來看一些文獻(xiàn)案例，為大家的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)打開思路吧~
CISH-/- iPSC-NK細(xì)胞提高抗腫瘤活性
研究人員將供體的皮膚或血細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），然后再定向分化為NK細(xì)胞（iPSC-NK細(xì)胞），在iPSC-NK細(xì)胞中利用CRISPR/Cas9技術(shù)將CISH基因敲除，該基因調(diào)控含SH2蛋白的表達(dá)（CIS；CISH的蛋白產(chǎn)物），CIS是信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。研究結(jié)果表明，CISH-/- iPSC-NK細(xì)胞在白血病異種移植模型中，敲除后的NK細(xì)胞增強(qiáng)了對(duì)腫瘤生長的抑制，而且敲除后的NK細(xì)胞在體內(nèi)的持久性也顯著增加了。CISH的缺失增強(qiáng)了NK細(xì)胞的功能，CIS通過調(diào)節(jié)人類 NK細(xì)胞代謝活性從而在抗腫瘤活性方面起著關(guān)鍵作用。
圖1. 從人類iPSC中構(gòu)建CISH-/- iPSC-NK細(xì)胞[1]
iPSC技術(shù)用于ASD發(fā)病機(jī)制研究
自閉癥譜系障礙 （ASD） 是一種復(fù)雜性的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，在表型和遺傳上具有異質(zhì)性。研究人員通過插入蛋白質(zhì)標(biāo)簽和提前終止密碼子，為iPSC細(xì)胞系中10個(gè)功能不同的ASD風(fēng)險(xiǎn)基因設(shè)計(jì)了完全敲除的基因編輯策略（AFF2/FMR2, ANOS1, ASTN2, ATRX, CACNA1C, CHD8, DLGAP2, KCNQ2, SCN2A, TENM1），且所有突變都在相同的“等基因”（遺傳背景相同）中產(chǎn)生，以此研究ASD風(fēng)險(xiǎn)基因的基因功能。將KO iPSC細(xì)胞誘導(dǎo)分化為興奮性神經(jīng)元，采用RNA測(cè)序?qū)φT導(dǎo)分化神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄特性進(jìn)行研究，揭示了幾個(gè)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的融合。同時(shí)使用膜片鉗和多電極陣列方法，發(fā)現(xiàn)不同突變的電生理缺陷是不同的，但它們最終會(huì)導(dǎo)致突觸活動(dòng)持續(xù)減少。盡管ASD易感基因?qū)儆诓煌幕虮倔w，但等基因的干細(xì)胞可以揭示常見的功能表型，例如神經(jīng)元連接功能降低。鑒于ASD的異質(zhì)性，這類基于CRISPR等基因的敲除系統(tǒng)可能對(duì)逐步控制的細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)是必不可少的。
圖2. iPSC細(xì)胞的KO與相關(guān)基因檢測(cè)[2]
在iPSC衍生的人類類器官疾病模型中研究miRs失調(diào)的病理途徑
microRNA （miRs） 是一類非編碼小RNA，它們?cè)诎l(fā)育和生理背景下具有重要的調(diào)節(jié)作用。Kung等在人類iPSC細(xì)胞中敲除了miR-26b莖環(huán)基因，以探索miR-26b在發(fā)育和疾病中的作用。該基因編輯的細(xì)胞系表現(xiàn)出正常的核型，表達(dá)多能性標(biāo)記并分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞。這為研究發(fā)育提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停㈥U明了iPSC衍生的人類類器官疾病模型中miR-26b下游調(diào)節(jié)異常的病理途徑。
圖3. iPSC細(xì)胞中miR-26b的敲除與鑒定[3]
F9基因敲入的iPSC細(xì)胞用于血友病治療
目前對(duì)血友病的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是細(xì)胞替代療法，雖然有效，但存在一定的病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，而且需要終身治療，只有基因療法才有可能從根本上治愈血友病。從患者的外周血單核細(xì)胞 （PBMC）中誘導(dǎo)，形成iPSC細(xì)胞，構(gòu)建了靶向AAVS1靶點(diǎn)的AAVS1-Cas9-sgRNA和AAVS1-EF1α-F9 cDNA-嘌呤霉素donor，并將它們通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入iPSC中，成功地將人全長F9 cDNA敲入iPSCs的AAVS1位點(diǎn)。然后將 iPSC分化為肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該肝細(xì)胞可以穩(wěn)定分泌人凝血因子IX （hFIX），并能夠在短期內(nèi)移植到非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷?。∟OD/SCID）小鼠中，這為血友病的臨床基因治療提供了一種新方法。
圖4. F9 cDNA插入HB iPSCs AAVS1位點(diǎn)[4]
iPSC細(xì)胞的雙敲除技術(shù)揭示細(xì)胞凋亡機(jī)制
已有研究表明，BAX和BAK在小鼠胚胎生長過程中都是必不可少的，并且在人類癌細(xì)胞系中證實(shí)了BAX和BAK在細(xì)胞凋亡過程中線粒體裂變中的作用。但是由于缺乏合適的研究模型，BAX和BAK在人類大腦發(fā)育中的功能仍然難以捉摸。Joshi等在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （hiPSCs）、hiPSC衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞 （hNPCs）、神經(jīng)玫瑰花結(jié)和大腦類器官中雙敲除BAX/BAK基因，用來揭示BAX和BAK缺失在體外模型中的對(duì)人類大腦早期發(fā)育的影響。發(fā)現(xiàn)BAX和BAK缺陷細(xì)胞具有異常的線粒體形態(tài)并導(dǎo)致皮質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。由此認(rèn)為BAX和BAK在人類發(fā)育過程中的關(guān)鍵功能，包括維持線粒體形態(tài)的穩(wěn)態(tài)，這對(duì)于皮質(zhì)祖細(xì)胞和神經(jīng)元的正常發(fā)育至關(guān)重要。
圖5. BAX/BAK DKO hiPSCs細(xì)胞死亡表型的表征和驗(yàn)證[5]
看完以上的案例解析，大家對(duì)IPSC實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是否已經(jīng)有了靈感，躍躍欲試了呢？然而IPSC基因編輯細(xì)胞的構(gòu)建是個(gè)耗時(shí)的過程，特別是單克隆細(xì)胞的篩選，費(fèi)事費(fèi)力；而且想要最終拿到基因編輯效果徹底的IPS細(xì)胞并不容易，例如在構(gòu)建的過程中，細(xì)胞培養(yǎng)條件的稍不注意便可能導(dǎo)致IPS細(xì)胞的分化。
參考文獻(xiàn)：
[1] Zhu, Huang et al. “Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity.” Cell stem cell . 27,2 （2020）: 224-237.e6.
[2] Deneault, Eric et al. “Complete Disruption of Autism-Susceptibility Genes by Gene Editing Predominantly Reduces Functional Connectivity of Isogenic Human Neurons.” Stem cell reports.11,5 （2018）: 1211-1225.
[3] Kung, Louise H W et al. “Generation of a miR-26b stem-loop knockout human iPSC line, MCRIi019-A-1, using CRISPR/Cas9 editing.” Stem cell research. 50 102118. 10 Dec. 2020.
[4] Lyu, Cuicui et al. “Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells from patients with hemophilia B using the CRISPR-Cas9 system.” Stem cell research & therapy vol. 9,1 92. 6 Apr. 2018.
[5] Joshi, Piyush et al. “Modeling the function of BAX and BAK in early human brain development using iPSC-derived systems.” Cell death & disease vol. 11,9 808. 25 Sep. 2020.
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