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1、儀器

2、材料

3、操作流程

①組織樣本預(yù)處理

在超凈臺(tái)內(nèi)，將組織從原代組織保存液中取出，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用含有雙抗的PBS抽吸沖洗15遍后，放置于盛有組織緩沖液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，對(duì)樣本進(jìn)行試驗(yàn)前狀態(tài)記錄。

使用無(wú)菌鑷子盡可能清理掉所有壞死組織及非上皮組織（例如肌肉或脂肪、結(jié)締組織），在培養(yǎng)皿或離心管中用無(wú)菌的剪刀/手術(shù)刀，對(duì)樣本進(jìn)行機(jī)械分離，將大塊的組織分離成為大約0.5-2 mm3 的細(xì)小碎片或糊糜狀。（剁碎至組織不卡1mL槍頭為最佳）

②消化液消化-終止

將經(jīng)過(guò)剁碎好的組織，完全轉(zhuǎn)移至 15 mL 無(wú)菌離心管中，并加入50倍剪碎組織懸液體積的組織消化液重懸，用 1 mL 槍頭輕輕吹打組織，使其充分分散；將含有該消化液的離心管放置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱，37℃ 條件下，1200 rpm 的轉(zhuǎn)速消化分離20-40分鐘，每隔10min均勻取10μL懸液到96孔進(jìn)行鏡檢觀察，觀察到有大量的類器官形態(tài)的細(xì)胞團(tuán)塊則即可終止消化。

在消化完成的組織懸液中加入胎牛血清至終濃度達(dá)2%-4%以減緩消化作用，同時(shí)輕輕吹打10次以上。用 100μm的篩網(wǎng)將細(xì)胞懸液過(guò)濾進(jìn)入新的15mL離心管中，用無(wú)菌 PBS 清洗篩網(wǎng)。

③細(xì)胞洗滌

將上述含有細(xì)胞濾液的離心管在4℃，1,200 rpm 條件下離心 3 min，小心去除上清。沉淀細(xì)胞用 PBS 清洗一次；向細(xì)胞沉淀中加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，4℃，1,200 rpm 條件下離心 3 min。

④原代組織樣本細(xì)胞活力檢測(cè)

取少量終止消化后的細(xì)胞懸液進(jìn)行原代組織樣本質(zhì)量檢測(cè)(一般選用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)染色，總細(xì)胞活力大于90%以上且總細(xì)胞量在104以上表明該原代組織樣本質(zhì)量良好)。

⑤基質(zhì)膠3D包裹

檢測(cè)剩余細(xì)胞懸液，于 200~300g離心力離心 3-5分鐘，吸去上清液保留沉淀，按每孔8000-10000個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)20-30μL基質(zhì)膠的比例計(jì)算加入相應(yīng)量的類器官基質(zhì)膠(以24 孔板為例)，并在冰上混勻(注意，混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡常溫混勻則需要控制在 15 秒內(nèi)) ，混勻后置于冰上。

注意：為確保培養(yǎng)過(guò)程中類器官基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，應(yīng)保持基質(zhì)膠的體積比在70%以上。

⑥種板培養(yǎng)

用移液器吸取基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合液移至細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，(如 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔點(diǎn)20 ~30μL混合懸液），混合懸液須點(diǎn)至培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開(kāi)后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中凝固30分鐘。待基質(zhì)膠凝固至不再流動(dòng)后，沿孔壁緩緩加入完全培養(yǎng)基（以24孔為例，加500μL完全培養(yǎng)基），將24孔板置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天更換一次完全培養(yǎng)基。

⑦組織類器官觀察

將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察類器官并拍照，了解初始類器官數(shù)量、增殖速度、形態(tài)、微生物污染情況等。