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編譯：不二，編輯：十九、江舜堯。

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單細(xì)胞技術(shù)

免疫系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)化為可以抵抗微生物病原體，但是也可以對組織損傷和經(jīng)歷了惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞做出反應(yīng)。它包括一個先天性的和適應(yīng)性的系統(tǒng)，每個系統(tǒng)都有細(xì)胞和可溶性成分。先天性的提供了立即反應(yīng)，一系列細(xì)胞類型起著前哨作用，并在整個人體組織中分布著快速的效應(yīng)因子。這些細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和一系列先天性淋巴細(xì)胞，不僅在防御中而且在組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中都具有關(guān)鍵作用。免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性需要時間來發(fā)育，并且在抗原識別后會產(chǎn)生高度特異性的反應(yīng)。這些應(yīng)答的核心是極為多樣化的B和T淋巴細(xì)胞受體，在B細(xì)胞受體的情況下，可以在免疫應(yīng)答過程中對抗原產(chǎn)生更高的親和力。適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)生在專門的次級淋巴器官（即脾、扁桃體和淋巴結(jié)）的網(wǎng)絡(luò)中，需要免疫細(xì)胞從血液和淋巴中遷移到這些組織結(jié)構(gòu)中（圖1）。

圖1 循環(huán)系統(tǒng)、次級淋巴器官和非淋巴器官中的免疫細(xì)胞定位。

免疫學(xué)家最早了解這種復(fù)雜系統(tǒng)的工作通過其形態(tài)特征對不同免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行分類，并且隨著技術(shù)的發(fā)展，它們可以表達(dá)不同的分子標(biāo)記基因。然后，根據(jù)影像學(xué)研究以及體外和體內(nèi)干擾研究（經(jīng)常使用小鼠作為模型），為這些表型和分子定義的細(xì)胞亞群分配特定的功能和解剖位置。流式細(xì)胞術(shù)是最簡單的單細(xì)胞技術(shù)，已經(jīng)使用了幾十年，以極高的通量測量單個細(xì)胞上的少量標(biāo)記基因（通常少于15個）來評估免疫細(xì)胞的分子組成。在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用之前，免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究很大程度上依賴于使用基因微陣列或RNA-seq，或著通過流式細(xì)胞儀、磁珠或密度梯度離心分離。過去十年來，隨著單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，科研人員以無標(biāo)記、無偏見的方式評估免疫細(xì)胞異質(zhì)性和功能。此類方法可生成高維數(shù)據(jù)，從而使細(xì)胞能夠得到大量標(biāo)記基因的表達(dá)（質(zhì)譜分析中>40）或轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因（通過scRNA-seq）或染色質(zhì)可及性圖譜（通過scATAC-seq）。新興的單細(xì)胞技術(shù)可以并行發(fā)現(xiàn)多種生物學(xué)信息，例如，同時進(jìn)行高水平的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)豐度檢測，或同時檢測轉(zhuǎn)錄本的豐度和DNA序列或染色質(zhì)可及性。這些方法可以了解調(diào)節(jié)相互作用，并能對細(xì)胞類型和狀態(tài)進(jìn)行數(shù)據(jù)豐富的定義。

大約5年前，scRNA-seq實驗開始探測組織的細(xì)胞成分。這些使用細(xì)胞分選和基于液滴微流控方法的研究可以描繪出不同轉(zhuǎn)錄的小鼠脾臟免疫細(xì)胞群，并描繪出脂多糖誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化，強(qiáng)調(diào)了這項技術(shù)表征小鼠肺上皮細(xì)胞譜系隨時間發(fā)育的能力。液滴微流控技術(shù)的發(fā)展和細(xì)胞條形碼技術(shù)能夠以無偏見的方式解析發(fā)育和成熟的心鼠組織的細(xì)胞種群結(jié)構(gòu)。在過去的幾年中，這些方法為大規(guī)模生產(chǎn)scRNA-seq數(shù)據(jù)鋪平了道路，這些實驗?zāi)軌蛏砂^100000個細(xì)胞的人類和小鼠組織的細(xì)胞圖譜的大規(guī)模數(shù)據(jù)集。目前可用的scRNA-seq方法使得能夠使用多孔板或微流控技術(shù)對單個細(xì)胞或核RNA進(jìn)行分離和分析（圖2），并已在其他綜述中進(jìn)行了深入描述。

除了在整個scRNA-seq方法中提供更高的便利性之外，技術(shù)進(jìn)步還允許同時對單細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測，例如CITE-seq或REAP-seq。這些方法以流式細(xì)胞術(shù)類似的方式用抗體標(biāo)記細(xì)胞；但是，抗體是用DNA條碼而不是熒光基團(tuán)標(biāo)記的。與目標(biāo)細(xì)胞中的RNA同時捕獲該DNA條碼，在逆轉(zhuǎn)錄步驟之后將其分離，并用于制備單獨的細(xì)胞表面蛋白特異性文庫。與抗體的DNA條形碼一起被捕獲，該條形碼唯一地標(biāo)識每個細(xì)胞，從而能夠?qū)?xì)胞表面蛋白表達(dá)進(jìn)行單細(xì)胞定量。與流式細(xì)胞術(shù)相比，該技術(shù)的主要優(yōu)勢在于它可以測量大量蛋白質(zhì)。在流式細(xì)胞儀中，熒光基團(tuán)的光譜重疊將標(biāo)記物的數(shù)量限制在15種左右。大規(guī)模的細(xì)胞學(xué)實驗受到同位素可用性的限制，限制在40種左右。但是，由8個堿基對組成的DNA條碼最多可產(chǎn)生65536個獨特的組合，理論上可以測量數(shù)千種蛋白質(zhì)。迄今為止，在單個實驗中已測量了約一百種蛋白質(zhì)，而目前的經(jīng)驗表明，結(jié)合評估表面蛋白質(zhì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以提高細(xì)胞聚類。未來的進(jìn)展應(yīng)該可以看到條形碼表位的發(fā)展，以便能夠研究抗原特異性B和T細(xì)胞。

這些高通量方法通常需要同時使用物理分解法和酶消化法將組織樣品解離為單細(xì)胞懸液。這種方法有許多缺點。首先，解離過程可以改變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，例如，通過上調(diào)應(yīng)激反應(yīng)的編碼熱激蛋白的基因。第二，器官的解離導(dǎo)致細(xì)胞的空間排列及其解剖定位有關(guān)的信息丟失。例如，腎臟的皮質(zhì)和延髓包含腎單位的不同部分，并具有不同的組織環(huán)境，延髓為駐留的免疫細(xì)胞提供了高鹽和低氧環(huán)境。因此，必須考慮單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究中每個細(xì)胞的精確解剖位置，以充分了解局部組織環(huán)境的影響。在單細(xì)胞分析中，可以使用兩種廣泛的方法來結(jié)合空間和轉(zhuǎn)錄信息（圖2）。首先是使用空間轉(zhuǎn)錄組方法將細(xì)胞條形碼與細(xì)胞的空間位置聯(lián)系起來，或者可以使用共聚焦顯微鏡結(jié)合RNA探針來識別組織切片上的轉(zhuǎn)錄本。

圖2 單細(xì)胞測序技術(shù)。

除了空間和高通量方法學(xué)的發(fā)展外，還可以看到功能強(qiáng)大且可擴(kuò)展的計算方法的快速發(fā)展，從而能夠分析由大規(guī)模細(xì)胞計數(shù)法和scRNA-seq實驗生成的大型單細(xì)胞數(shù)據(jù)集。這些方法包括對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類、計算重建發(fā)育軌跡和推斷細(xì)胞間分子網(wǎng)絡(luò)的工具。還開發(fā)了整合不同實驗批次或使用不同方法生成的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析的方法。此類方法將通過消除技術(shù)批次效應(yīng)來實現(xiàn)細(xì)胞類型的比對，并允許對不同實驗條件和生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行比較。

免疫學(xué)家已迅速將中高通量的scRNA-seq方法應(yīng)用于人類樣本，以解決有關(guān)免疫細(xì)胞異質(zhì)性、個體發(fā)育、細(xì)胞極化和細(xì)胞命運的問題，并鑒定罕見的以前未鑒定的細(xì)胞亞群。盡管這些實驗集中于循環(huán)系統(tǒng)中最容易獲得的免疫細(xì)胞，但現(xiàn)在組織處理的改善使研究人員能夠?qū)⑵溲芯糠秶鷶U(kuò)大到相對稀少的組織駐留免疫細(xì)胞，以及發(fā)育和疾病狀態(tài)。在以下各節(jié)中，研究者將討論使用單細(xì)胞技術(shù)定義跨不同細(xì)胞區(qū)室的免疫細(xì)胞的研究，重點是人體研究。這些實驗說明了這些方法在解決有關(guān)免疫系統(tǒng)及其在腎臟動態(tài)平衡和疾病中的作用的特定問題的潛力。

外周血中的免疫細(xì)胞圖譜

外周血代表了人類中最容易接近的免疫區(qū)域。除T淋巴細(xì)胞外，大多數(shù)免疫細(xì)胞都在骨髓中發(fā)育，一旦成熟便遷移到循環(huán)系統(tǒng)中。因此，血液提供了整個生物體免疫狀態(tài)但不完整的圖譜。如以下各節(jié)所述，將單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于研究外周血白細(xì)胞有可能為免疫細(xì)胞生物學(xué)提供許多見解（圖3）。此外，由于許多腎臟疾病是由全身免疫細(xì)胞群的擾動引起的，更好的循環(huán)免疫細(xì)胞概況分析可能有助于疾病的診斷和預(yù)后，提高對疾病機(jī)制的了解并促進(jìn)疾病活動生物標(biāo)記基因的發(fā)展。

圖3 外周血中的免疫細(xì)胞圖譜。

血液圖譜

在scRNA-seq出現(xiàn)之前，循環(huán)細(xì)胞亞群中異質(zhì)性的研究，依賴于使用已知的標(biāo)記基因來鑒定和分析細(xì)胞頻率、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本和細(xì)胞功能。scRNA-seq方法使研究人員能夠以無偏見的方式分析循環(huán)細(xì)胞，這種方法改善了人們對循環(huán)細(xì)胞異質(zhì)性和相互關(guān)系的理解。一個例子是進(jìn)行68000個PBMC的scRNA-seq描繪外周血中淋巴樣和髓樣細(xì)胞群體的整體結(jié)構(gòu)的研究，強(qiáng)調(diào)了這種方法表征罕見細(xì)胞亞群的能力，并提供了與疾病狀態(tài)進(jìn)行比較的有用的參考數(shù)據(jù)集。

新的細(xì)胞類型的鑒定

除了以無偏見的方式分析大量細(xì)胞的能力以外，scRNA-seq還可以了解循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞異質(zhì)性，并鑒定新的細(xì)胞亞群（圖3a）。如果新的細(xì)胞亞群很少見，則可能需要使用已知標(biāo)記基因預(yù)先富集感興趣的特定免疫細(xì)胞群，以確保有合理數(shù)量的細(xì)胞用于分析。一旦富集，scRNA-seq可應(yīng)用于此類細(xì)胞群體并評估是否存在其他多樣性，或者實際是否存在稀有的新型免疫細(xì)胞亞群。目前，在這方面的許多努力都集中在常規(guī)的DC細(xì)胞（cDC）上，它們是重要的抗原呈遞細(xì)胞（APC），它們在通過激活CD4⁺ T細(xì)胞啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。cDC擁有兩個主要細(xì)胞子集：cDC1表達(dá)CLEC9A和CD141并交叉呈遞抗原，而cDC2表達(dá)CD1c并起經(jīng)典APC的作用。一項針對2400種分選的單核吞噬細(xì)胞（MNP）scRNA-seq研究，包括單核細(xì)胞、cDC和漿細(xì)胞樣DC（pDC），可以更好地了解cDC的異質(zhì)性而不依賴于表面標(biāo)記基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了與已報道的cDC2和cDC1相對應(yīng)的DC細(xì)胞子集，以及cDC2細(xì)胞的其他炎癥細(xì)胞群體。這種方法使研究人員能夠?qū)?/span>pDC與表達(dá)AXL和SIGLEC6的新型DC區(qū)分開來。這些DC在功能和形態(tài)上與pDC有所不同，強(qiáng)調(diào)了單細(xì)胞技術(shù)識別罕見的新型免疫細(xì)胞亞群的能力。

細(xì)胞前體的表征

通過評估骨髓中未成熟免疫細(xì)胞和血液中成熟免疫細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性，以及繪制發(fā)育階段之間的轉(zhuǎn)錄軌跡來確定免疫細(xì)胞前體（圖3b）。在這種情況下，大多數(shù)使用scRNA-seq的研究都試圖表征cDC的前體（pre-cDC）。cDCs來自骨髓來源的祖細(xì)胞，即常見的DC祖細(xì)胞，該細(xì)胞分化為pre-cDC，它是cDC的直接前體。通過對外周血和臍帶血中分離的cDC1和cDC2進(jìn)行scRNA-seq測序，研究pre-cDC是否已經(jīng)極化到cDC1或cDC2命運時發(fā)現(xiàn)，pre-cDC由兩個不同的細(xì)胞前體群體組成，未來發(fā)育成為cDC1或cDC2。另一項研究通過流式細(xì)胞術(shù)分選的cDC的scRNA-seq，在成人外周血中發(fā)現(xiàn)了一種罕見的cDC祖細(xì)胞，并認(rèn)為可以產(chǎn)生pre-DC1和pre-DC2。另一項研究進(jìn)一步完善了循環(huán)DC前體的性質(zhì)，該研究結(jié)合了細(xì)胞計數(shù)法（CyTOF）和scRNA-seq并通過標(biāo)記CD123、CD33和CD45RA鑒定人血DC前體。這些pre-DC與pDC共享表面標(biāo)記基因，并具有不同的功能特性。此外，追蹤DCs從骨髓到外周血的分化鑒定出pre-DC不同譜系的亞群。

離體干擾研究

眾所周知是，特定亞群內(nèi)的免疫細(xì)胞對刺激的反應(yīng)不同。單細(xì)胞技術(shù)是理想的工具，可以用來描述這種異質(zhì)響應(yīng)的基礎(chǔ)機(jī)制（圖3c）。例如，可以像在脂多糖刺激的鼠脾細(xì)胞研究中所做的那樣，在單個細(xì)胞中分析響應(yīng)刺激而發(fā)生的轉(zhuǎn)錄變化。一種更先進(jìn)的方法是使用創(chuàng)新的基于液滴的微流控平臺，該平臺將單細(xì)胞細(xì)胞因子分析與scRNA-seq分析相結(jié)合，以研究人外周血來源的pDC響應(yīng)Toll樣受體配體的刺激而產(chǎn)生I型干擾素。通過調(diào)節(jié)微滴的微環(huán)境，研究人員表明，I型干擾素的產(chǎn)生僅限于單個刺激的pDC的一小部分亞群，并且該功能受隨機(jī)基因調(diào)控的控制。實際上，pDC細(xì)胞因子反應(yīng)是由細(xì)胞自主I型干擾素擴(kuò)增環(huán)驅(qū)動的。

細(xì)胞功能的理解

早期研究全身性自身免疫性疾?。ò切┯绊懩I臟的疾?。┗颊呙庖呒?xì)胞功能障礙的性質(zhì)和機(jī)制的嘗試，主要涉及大量PBMC的轉(zhuǎn)錄譜分析。這些研究為免疫細(xì)胞功能障礙時發(fā)生的分子變化提供了一些見解，例如，SLE患者的I型干擾素信號的鑒定。通過使用流式細(xì)胞儀分離細(xì)胞群體后，對群體進(jìn)行概要分析，可以進(jìn)一步深入了解介導(dǎo)與疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化的確切細(xì)胞亞群。例如，一項2015年的研究表明，CD8⁺ T細(xì)胞衰竭的特征可識別出多種自身免疫疾病的預(yù)后較好且復(fù)發(fā)率較低的患者。這些研究通常包括數(shù)百個病例和對照，由于技術(shù)的費用，這種數(shù)量規(guī)模的外周血樣本不適于scRNA-seq研究。但是，隨著成本下降和通量增加，對患者和健康對照者的外周血樣本進(jìn)行scRNA-seq研究將變得可行，并有可能進(jìn)一步解決病原性細(xì)胞亞群和信號通路（圖3d）。

目前已經(jīng)朝著這個方向邁出了第一步。例如，對PBMC的高通量scRNA-seq研究利用了轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中存在的序列變異，可以在異體骨髓移植之前和之后在骨髓單核細(xì)胞之間區(qū)分宿主衍生細(xì)胞和供體衍生細(xì)胞。這個例子強(qiáng)調(diào)了這種方法在干細(xì)胞和骨髓移植或?qū)嶓w器官移植的背景下提高我們對宿主和供體來源細(xì)胞命運的理解。

次級淋巴器官的免疫細(xì)胞

次級淋巴器官代表產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)的位點。這個過程需要B和T淋巴細(xì)胞和APC的動態(tài)空間精確定位，這種動態(tài)定位是由淋巴結(jié)和脾臟內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞來協(xié)調(diào)的。盡管在小鼠中的研究表明，這些技術(shù)可用于追蹤抗原特異性B和T細(xì)胞克隆，但在人類次級淋巴器官中的高維單細(xì)胞研究卻很少；可以研究不循環(huán)的免疫細(xì)胞亞群，但僅限于外周器官和次級淋巴組織；并探究淋巴結(jié)免疫區(qū)和基質(zhì)區(qū)之間的相互作用（圖4）。

圖4 淋巴器官中的免疫細(xì)胞圖譜。

抗原特異性淋巴細(xì)胞克隆

B和T淋巴細(xì)胞受體對于產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要。編碼這些受體的抗原識別結(jié)構(gòu)域的基因組區(qū)域在稱為V（D）J重組的過程中經(jīng)歷了廣泛的重組事件，以生成種類繁多的特異性結(jié)合自身抗原和非自身抗原的受體。在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的過程中，抗原特異性淋巴細(xì)胞的選擇和增殖可確保該應(yīng)答具有強(qiáng)大性和特異性。在免疫應(yīng)答過程中，B細(xì)胞受體及其分泌的抗體的抗原親和力增強(qiáng)，從而進(jìn)一步完善了抗體應(yīng)答的特異性。單細(xì)胞水平的克隆多樣性可通過RNA-seq（圖4a）進(jìn)行評估，并已被用于小鼠模型中追蹤沙門氏菌和瘧疾感染整個過程中不同T淋巴細(xì)胞克隆的命運。這些方法也為研究免疫系統(tǒng)發(fā)育贏得了關(guān)注。例如，人類胎兒腸道中的T記憶淋巴細(xì)胞與其初始細(xì)胞相比，顯示出克隆擴(kuò)增，表明存在組織駐留適應(yīng)性免疫體系結(jié)構(gòu)。這些技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用可能有助于我們了解免疫發(fā)育、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、感染以及同種異體移植耐受和排斥的背景下組織駐留淋巴細(xì)胞的克隆情況。

非循環(huán)免疫細(xì)胞測序分析

一些免疫細(xì)胞亞群以極少數(shù)的形式存在于循環(huán)或非循環(huán)系統(tǒng)中，殘留在組織或次級淋巴器官中。因此，直接研究次級淋巴器官可以更好地了解這些細(xì)胞生物學(xué)特性（圖4b）。這些非循環(huán)免疫細(xì)胞包括在淋巴結(jié)和脾臟內(nèi)具有特定功能的常駐巨噬細(xì)胞子集，例如淋巴結(jié)莢膜下囊竇巨噬細(xì)胞，脾紅髓巨噬細(xì)胞和邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞。另外，許多先天淋巴細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中的存在非常有限，這促使研究者將精力集中在淋巴器官上。一項研究繪制了自然殺手（NK）細(xì)胞和三個非細(xì)胞毒性先天性淋巴樣細(xì)胞（ILC）亞群的轉(zhuǎn)錄譜，這些分選的淋巴細(xì)胞表達(dá)CD127但不表達(dá)人類扁桃體的抗原特異性T細(xì)胞受體，并證明了ILC3s之間存在異質(zhì)性。另一項將scRNA-seq應(yīng)用于脾臟和血液NK細(xì)胞的研究，報道了小鼠和人類的血液和脾臟NK細(xì)胞群體內(nèi)的大量轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)了兩個廣泛的NK細(xì)胞亞群，它們在各個器官和物種中均是保守的。這些NK種群表現(xiàn)出不同的功能特征，其中NK1細(xì)胞表現(xiàn)出豐富的細(xì)胞毒性特征，而NK2細(xì)胞表現(xiàn)出豐富的趨化因子表達(dá)特征，表達(dá)了保守的DC趨化因子基因XCL1。

免疫-基質(zhì)細(xì)胞相互作用

淋巴結(jié)和脾臟中的基質(zhì)細(xì)胞在將免疫細(xì)胞組織成特定的微生態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，以實現(xiàn)有效免疫反應(yīng)所需的順序免疫細(xì)胞的相互作用。濾泡DC和邊緣網(wǎng)狀細(xì)胞可協(xié)調(diào)B細(xì)胞在濾泡中的定位，濾泡DC和邊緣網(wǎng)狀細(xì)胞是產(chǎn)生B細(xì)胞吸引趨化因子（如CXCL13）和細(xì)胞因子（如B細(xì)胞激活因子BAFF）的基質(zhì)細(xì)胞亞群，可促進(jìn)B細(xì)胞存活。在T細(xì)胞區(qū)，表達(dá)CCL21和CCL19的基質(zhì)細(xì)胞（稱為T區(qū)網(wǎng)狀細(xì)胞TRC）吸引表達(dá)CCR7的淋巴細(xì)胞。一項使用基于液滴的scRNA-seq研究，在穩(wěn)態(tài)條件下和病毒攻擊后分選CD45和CD31雙陰性小鼠淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞，鑒定出九個基質(zhì)細(xì)胞簇，包括已知的細(xì)胞簇，但也包括幾個新的細(xì)胞簇。研究人員特別指出，TRC內(nèi)部存在異質(zhì)性，CCL19^low TRC位于T細(xì)胞區(qū)域周邊，CXCL9⁺TRC位于T細(xì)胞區(qū)域和卵泡間區(qū)域，包膜和髓質(zhì)血管中有表達(dá)CD34的基質(zhì)細(xì)胞，髓索中有吲哚乙胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶陽性基質(zhì)細(xì)胞，以及分布更廣泛的Nr4a1陽性基質(zhì)細(xì)胞群。他們的工作進(jìn)一步完善了我們對淋巴結(jié)內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞的理解，并表明即使處于體內(nèi)穩(wěn)態(tài)某些細(xì)胞亞群似乎處于激活狀態(tài)（圖4b）。將這些研究擴(kuò)展到人淋巴結(jié)和脾臟，將改善我們對如何促進(jìn)或抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)的理解，尤其是有助于自身免疫或同種免疫反應(yīng)。

非淋巴器官中的免疫細(xì)胞

所有器官，包括腎臟，都包含一個免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)對受損組織和微生物攻擊的反應(yīng)，并有助于維持器官的穩(wěn)態(tài)。研究者從小鼠的研究中獲得了許多關(guān)于組織駐留免疫細(xì)胞的見解。由于新鮮組織樣本的可獲得性有限，對人類組織駐留免疫細(xì)胞的了解還很少。相對于上皮和內(nèi)皮中的組織駐留免疫細(xì)胞數(shù)量少，這帶來了另一個挑戰(zhàn)。因此，檢測大塊組織樣本的轉(zhuǎn)錄組的研究很可能會錯過重要的免疫細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄特征，因為這些特征主要是由大量上皮細(xì)胞獲得的強(qiáng)信號所介導(dǎo)的。scRNA-seq可以解決這個問題。小鼠中的研究表明，與環(huán)境接觸的非免疫器官，例如腸道和皮膚，也可能有助于病原體感應(yīng)和組織防御。此外，在腎臟上觀察到，上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間也會發(fā)生交流，例如，通過趨化因子的產(chǎn)生來了解免疫細(xì)胞的特定解剖位置。確實，局部免疫反應(yīng)和隨后的組織修復(fù)是免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞之間協(xié)同相互作用的結(jié)果。對器官（例如在穩(wěn)態(tài)條件下的腎臟）進(jìn)行scRNA-seq研究，有可能揭示非淋巴器官內(nèi)免疫細(xì)胞群的真正異質(zhì)性，有助于我們了解免疫細(xì)胞的存在，以及對組織環(huán)境和免疫細(xì)胞的適應(yīng)性與器官環(huán)境中非免疫細(xì)胞的相互作用（圖5）。

圖5 腎臟中的免疫細(xì)胞圖譜。

免疫細(xì)胞異質(zhì)性

人體器官中免疫細(xì)胞的研究通常依賴于將顯微鏡應(yīng)用于活檢或尸檢樣品。但是，這種方法在評估樣品中免疫細(xì)胞異質(zhì)性的能力上受到可同時評估的標(biāo)記數(shù)量（一般小于4）的限制。顯微鏡檢查還依賴于特異性抗體對于結(jié)合固定組織切片的已知免疫細(xì)胞標(biāo)記物。這種局限性導(dǎo)致對人體器官內(nèi)免疫細(xì)胞亞群異質(zhì)性的認(rèn)識不完全。scRNA-seq具有對組織內(nèi)免疫細(xì)胞進(jìn)行公正評估的潛力，但可能需要預(yù)選擇步驟，例如使用微流分選、磁珠選擇或密度梯度離心來富集樣品中的稀有細(xì)胞群（圖5a）。

2019年對人肺的一項研究提供了該技術(shù)在器官內(nèi)生成完整免疫細(xì)胞圖譜。通過對氣管不同部位的活檢樣品進(jìn)行scRNA-seq，研究人員鑒定出嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC、NK細(xì)胞、B和T淋巴細(xì)胞，以及具有循環(huán)記憶細(xì)胞和組織駐留記憶細(xì)胞特征的新型遷徙CD4⁺ T細(xì)胞亞群。該研究還證實了肺離子細(xì)胞的存在，肺離子細(xì)胞是scRNA-seq研究鑒定出的肺上皮細(xì)胞群體，獨特表達(dá)囊性纖維化跨膜介導(dǎo)調(diào)節(jié)（CFTR）基因（即在囊性纖維化中突變的基因）?，F(xiàn)在認(rèn)為這小部分細(xì)胞代表了氣管上皮中生理CFTR活性的主要來源，對囊性纖維化研究具有重要意義。

同樣，對五種健康的人類肝臟樣本的8444個細(xì)胞進(jìn)行了測序，鑒定出20種離散的肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膽管細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、常規(guī)αβ CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、NK樣細(xì)胞和不同的肝內(nèi)MNP細(xì)胞。后者包括兩個表達(dá)CD68的巨噬細(xì)胞群，一個具有更強(qiáng)的促炎性，另一個具有更強(qiáng)的耐受性。

這些研究共同說明了scRNA-seq在描述健康組織中免疫細(xì)胞異質(zhì)性方面的潛力，并提供了一個平臺來研究這些細(xì)胞如何促進(jìn)器官體內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及它們?nèi)绾胃淖兗膊　?/span>

免疫細(xì)胞發(fā)育

在小鼠中，組織巨噬細(xì)胞可以起源于卵黃囊或胎兒肝祖細(xì)胞，這些卵黃囊或胎兒肝祖細(xì)胞是出生前擁有的或來源于造血干細(xì)胞，并不斷從循環(huán)單核細(xì)胞中補(bǔ)充。對于循環(huán)細(xì)胞，scRNA-seq數(shù)據(jù)對潛在前體與分化的組織巨噬細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性和軌跡進(jìn)行定量，可以推斷出巨噬細(xì)胞的個體發(fā)育（圖5b）。

組織特性

體內(nèi)每個器官的穩(wěn)態(tài)功能所產(chǎn)生的環(huán)境是獨特的，并且會影響器官內(nèi)駐留的免疫細(xì)胞的基礎(chǔ)活化狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄組。例如，腸道中的免疫細(xì)胞必須適應(yīng)它們與腸腔內(nèi)數(shù)萬億種微生物的緊密環(huán)境，而腎臟髓質(zhì)內(nèi)的那些則暴露于明顯的高鹽環(huán)境。小鼠巨噬細(xì)胞的研究表明，由于來自局部細(xì)胞鄰域的線索以及對周圍環(huán)境的采樣，駐留在不同器官中的巨噬細(xì)胞采用了組織特異性轉(zhuǎn)錄基因標(biāo)記。使用scRNA-seq對不同器官中免疫細(xì)胞亞群的比較，將為組織駐留免疫細(xì)胞的器官特異性標(biāo)記基因提供更大的見解（圖5c）。此外，由于已經(jīng)在許多中心建立了從器官供體采集多個樣品的基礎(chǔ)設(shè)施，因此對來自人體器官的細(xì)胞進(jìn)行此類研究的能力已成為現(xiàn)實。

免疫細(xì)胞相互作用

組織駐留的免疫細(xì)胞占據(jù)特定的位置，周圍的細(xì)胞產(chǎn)生吸引和容納它們的趨化因子，以及保持活力所需的存活因子。循環(huán)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞還必須與器官內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密相互作用。另外，最近幾年的小鼠研究表明，一些組織駐留的免疫細(xì)胞與可電激發(fā)的組織緊密相互作用。例如，心臟巨噬細(xì)胞與心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的心肌細(xì)胞形成間隙連接，以促進(jìn)電傳導(dǎo)。在腸道中，巨噬細(xì)胞與腸神經(jīng)元相互作用，促進(jìn)蠕動，某些轉(zhuǎn)錄上不同的巨噬細(xì)胞亞群與組織脈管系統(tǒng)緊密結(jié)合。scRNA-seq提供了一種研究這些基礎(chǔ)相互作用的方法，因為可以為每種細(xì)胞類型生成受體和配體表達(dá)的目錄，并根據(jù)這些數(shù)據(jù)推斷出相互作用（圖5d）。現(xiàn)在，許多研究人員已使用這種方法來研究組織內(nèi)免疫細(xì)胞相互作用的性質(zhì)。例如，使用scRNA-seq探索發(fā)育中的小鼠肺組織內(nèi)的配體-受體，研究表明肺部環(huán)境中產(chǎn)生的信號（IL-33和GM-CSF）引發(fā)了肺部嗜堿性粒細(xì)胞的嗜堿性，因此嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)了特定的標(biāo)記基因，使他們能夠支持肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)育。另一項小鼠胃腸道內(nèi)上皮scRNA-seq的研究表明，細(xì)胞具有多種亞群，并闡明了這些細(xì)胞如何保持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并與病原體相互作用。此外，這項研究還確定了細(xì)胞簇的兩個特定亞簇，其中一個表達(dá)Tslp，它通過TH2 CD4⁺ T細(xì)胞和ILC2s提升TH2細(xì)胞應(yīng)答來介導(dǎo)上皮-免疫相互作用。

其他大規(guī)模分析研究其他器官的信號網(wǎng)絡(luò)也提供類似的見解。目前，使用人體胎盤組織進(jìn)行了最全面的人體器官系統(tǒng)中細(xì)胞間通訊的研究。使用scRNA-seq以單細(xì)胞分辨率在人胎盤內(nèi)定位信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，可區(qū)分一系列母體和胎兒以及免疫和非免疫細(xì)胞類型。參與該研究還開發(fā)了CellPhoneDB的工具，可以查詢不同細(xì)胞類型中配體-受體的表達(dá)，從而有助于分析免疫細(xì)胞與其他組織駐留細(xì)胞類型的相互作用。該工具現(xiàn)在已可用于scRNA-seq數(shù)據(jù)集。

解剖定位

如前所述，高通量scRNA-seq和質(zhì)譜分析實驗利用解離的組織樣品，不可避免地會丟失有關(guān)器官內(nèi)細(xì)胞解剖位置的信息（圖5e）。許多例子表明，器官內(nèi)免疫細(xì)胞的特定定位是優(yōu)化器官防御和功能所必需的。例如，在皮膚中，DC位于毛囊附近，以便對皮膚進(jìn)行最佳采樣，而具有高吞噬能力的腎巨噬細(xì)胞位于髓質(zhì)和骨盆中，以處理從膀胱來的細(xì)菌。通過參考活檢位置，可以在宏觀解剖學(xué)上解決使用解離的組織樣本的實驗。但是，將需要使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法來了解特定細(xì)胞群體在3D空間中的相互作用。

衰老和疾病的免疫

scRNA-seq還具有解決許多重要問題的潛力，這些問題涉及衰老和疾病期間組織內(nèi)免疫細(xì)胞的變化。例如，研究人員將患病或衰老組織的單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組與健康或年輕組織的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較。2019年的一項研究使用大規(guī)模細(xì)胞計數(shù)法和scRNA-seq研究克羅恩病患者發(fā)炎和未發(fā)炎的回腸的細(xì)胞圖譜，利用炎性巨噬細(xì)胞的信號，表明發(fā)炎組織中炎癥巨噬細(xì)胞和成熟DC的富集以及組織病原細(xì)胞的組成。該細(xì)胞模塊相關(guān)的基因表達(dá)與抗腫瘤壞死因子（TNF）治療的抗性相關(guān)，為診斷患者進(jìn)行分層提供參考。在一項針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的研究中，在關(guān)節(jié)置換術(shù)時對20000多個滑膜細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq測序。該研究鑒定了13個細(xì)胞簇，包括CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞和肥大細(xì)胞，以及幾種不同類型的成纖維細(xì)胞。免疫細(xì)胞中富含炎性細(xì)胞因子基因，并且發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞亞簇具有高表達(dá)的XCL1和XCL2，這些趨化因子已被證明可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶，表明可能驅(qū)動疾病的細(xì)胞間相互作用。

與具有粘膜面向外部環(huán)境的組織相反，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）是無菌的部位。小膠質(zhì)細(xì)胞是人類CNS中的MNP細(xì)胞群體，被認(rèn)為在健康和疾病中具有多種作用。對小鼠和人類腦細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，可以研究小膠質(zhì)細(xì)胞和血管周巨噬細(xì)胞。這種方法已擴(kuò)展到阿爾茨海默癥的小鼠模型，能夠鑒定出與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)的獨特的小膠質(zhì)細(xì)胞群體，名為疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）。這些細(xì)胞可感知并響應(yīng)神經(jīng)退行性變，并引起保護(hù)性反應(yīng)。有趣的是，HIV感染患者的腦脊液中免疫細(xì)胞的scRNA-seq識別出了罕見的小膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞富含阿爾茨海默癥小鼠中鑒定出的相同DAM標(biāo)記基因。許多研究人腦中不同的小膠質(zhì)細(xì)胞群體及其與疾病的關(guān)系。例如，一項使用scRNA-seq、單分子熒光原位雜交和免疫組化技術(shù)的研究，在發(fā)育、健康和疾病群體中研究小鼠和人類小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)圖譜。對健康人腦和多發(fā)性硬化癥患者的大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的分析中，研究人員鑒定出了7個小膠質(zhì)細(xì)胞簇，其中兩個富集于多發(fā)性硬化癥患者的大腦中，而一個專屬于多發(fā)性硬化癥患者的大腦。這些數(shù)據(jù)表明，即使在健康群體中，人類的小膠質(zhì)細(xì)胞以及轉(zhuǎn)錄上與疾病相關(guān)的細(xì)胞亞群也存在異質(zhì)性。另一項研究對健康大腦和受多種疾?。òò柎暮ＤY和多發(fā)性硬化癥）影響的患者的大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分析，結(jié)果表明與疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組多樣性與小鼠中鑒定的DAM表達(dá)譜一致。同一研究小組還檢測了老年人的小膠質(zhì)細(xì)胞，并鑒定了一系列基因，這些基因在老年人腦中優(yōu)先由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，并富含阿爾茨海默氏癥和多發(fā)性硬化癥的易感基因。

腫瘤代表獨特的疾病狀態(tài)，并改變組織環(huán)境以創(chuàng)造抑制免疫細(xì)胞活化的環(huán)境。使用單細(xì)胞技術(shù)可以更好地研究這種現(xiàn)象的機(jī)制。例如，許多研究小組將scRNA-seq與T細(xì)胞受體重組相結(jié)合，更好地了解調(diào)節(jié)各種癌癥（包括肝細(xì)胞癌、卵巢癌和結(jié)腸直腸癌）中與腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞克隆性和功能障礙的機(jī)制。

這些研究共同說明了單細(xì)胞技術(shù)可以提供健康和疾病組織免疫研究的見解，并提供了可用于人類腎臟免疫研究的手段。

健康人群的腎臟免疫

腎臟通過排泄廢物和酸并維持電解質(zhì)和水的平衡，在維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用。它們還產(chǎn)生刺激紅細(xì)胞生成的激素以預(yù)防貧血（促紅細(xì)胞生成素），以及1α-羥化酶生成維生素D以保持骨骼的鈣和磷酸鹽水平。腎臟中的各種細(xì)胞（包括上皮細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞以及免疫細(xì)胞）的相互作用來維持正常的腎功能。由于腎臟穩(wěn)態(tài)功能，在腎臟組織環(huán)境中存在區(qū)域差異（圖5e）。腎臟的延髓和內(nèi)部區(qū)域擁有較高的間質(zhì)鈉濃度，這主要是由于Henle環(huán)內(nèi)的離子運輸所致，這是腎臟實現(xiàn)體內(nèi)水分吸收再平衡功能所必需的。腎臟也是一個動態(tài)的環(huán)境，腎臟內(nèi)的鈉濃度梯度調(diào)節(jié)取決于生理需要。例如，由于脫水和血清滲透壓升高，垂體后葉分泌的血管加壓素增加了腎臟對游離水的重吸收，并在髓質(zhì)中進(jìn)一步增加了間質(zhì)鈉濃度。除鹽差異外，明顯的加氧作用的區(qū)域差異也很明顯。遠(yuǎn)端腎單位的血液供應(yīng)隨腎小球小動脈的血管收縮程度而變化，并且腎小管細(xì)胞將電解質(zhì)、葡萄糖和氨基酸輸送到間質(zhì)的代謝要求，導(dǎo)致延髓中不同程度的缺氧。這些環(huán)境條件可能通過直接影響免疫細(xì)胞，或由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，在塑造器官的免疫結(jié)構(gòu)中發(fā)揮巨大作用。

腎臟內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜的首次研究是在健康的小鼠腎臟中進(jìn)行的。研究人員使用scRNA-seq的方法鑒定了腎單位上皮細(xì)胞的主要亞群，包括足細(xì)胞、近端小管上皮細(xì)胞、Henle環(huán)細(xì)胞、遠(yuǎn)端小管和收集管細(xì)胞。收集管細(xì)胞包含一種新型的過渡細(xì)胞類型，該類型的細(xì)胞能夠在閏細(xì)胞和主細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。這項研究強(qiáng)調(diào)了小鼠腎臟中存在免疫細(xì)胞的多樣性，包括巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B和T淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)得到了另一個研究的補(bǔ)充，該研究使用scATAC-seq評估了13個小鼠組織（包括腎臟中的上皮、內(nèi)皮和免疫細(xì)胞）大約100000個單細(xì)胞的染色質(zhì)可及性。這項研究表明，來自腎臟、心臟和肝臟的組織巨噬細(xì)胞顯示出染色質(zhì)可及性的常見模式，這與肺泡巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的模式不同。

目前，在健康人群中全面研究腎臟免疫種群的能力還很有限。一項研究利用22000個細(xì)胞生成轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，提供人腎臟中細(xì)胞類型的圖譜，報道了一組異質(zhì)的免疫細(xì)胞，包括B細(xì)胞和漿細(xì)胞、兩個髓樣細(xì)胞亞群、T細(xì)胞，NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞。我們小組還對人的腎臟進(jìn)行了大規(guī)模研究，使用scRNA-seq對不同壽命人類的14個腎臟以及6個胎兒人腎臟中的67000多個細(xì)胞進(jìn)行了分析。我們的發(fā)現(xiàn)證實了人類腎臟內(nèi)存在復(fù)雜的免疫環(huán)境，主要表現(xiàn)為MNP細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞。髓樣細(xì)胞的精細(xì)聚集顯示了兩個單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞群，一個與CD14⁺經(jīng)典單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄相似，另一個與CD16⁺非經(jīng)典單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄相似，以及一個獨特的組織巨噬細(xì)胞群。人腎中的DC主要表達(dá)與cDC2表型一致的標(biāo)記基因，例如CD1C。我們還考慮了腎臟內(nèi)免疫細(xì)胞的宏觀解剖定位，參考了從已知腎臟區(qū)域采集的活檢樣本中獲得的大量RNA序列數(shù)據(jù)。該分析顯示了皮質(zhì)與髓質(zhì)和骨盆之間的免疫細(xì)胞亞群的分布差異。配體-受體相互作用的分析表明，由于盆腔上皮細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)模式，中性粒細(xì)胞和抗菌MNPs在盆腔富集。利用小鼠模型，研究者證實了這些相互作用將中性粒細(xì)胞特異性地定位在腎臟區(qū)域。因此，我們的研究表明，人類腎臟是一個高度組織化的免疫環(huán)境，不同的區(qū)域表現(xiàn)出功能特異性，這些區(qū)域可能適應(yīng)主要的免疫挑戰(zhàn)。

另一個研究小組使用大量細(xì)胞計數(shù)法分析了人類腎臟樣品中的免疫細(xì)胞。盡管這項研究的重點是腎細(xì)胞癌（RCC），但研究人員還對健康的腎臟組織進(jìn)行了細(xì)胞計數(shù)作為比較。使用一組互補(bǔ)的標(biāo)記基因可以分離T細(xì)胞和髓細(xì)胞異質(zhì)性。研究結(jié)果表明正常腎臟樣本中CD4⁺中樞記憶T細(xì)胞，CD4⁺和CD8⁺效應(yīng)記憶T細(xì)胞富集。然而，正常樣本中沒有表達(dá)PD-1的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和T細(xì)胞，表明腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制程度增強(qiáng)。研究人員還觀察了正常腎臟組織中的經(jīng)典和非經(jīng)典單核細(xì)胞，在健康組織中有一群表達(dá)CD206、M2極化的組織駐留巨噬細(xì)胞。

對發(fā)育中的人類腎臟的研究，不僅揭示了上皮細(xì)胞發(fā)育的模式，而且還揭示了在妊娠87-132天的時間里，主要表達(dá)組織相容性復(fù)合體II類（MHCII）基因的組織駐留免疫細(xì)胞。與胎兒腎臟早期出現(xiàn)巨噬細(xì)胞的研究一致，在人類胎兒腎臟中的研究顯示了表達(dá)MHC II類基因、IL1B和FCER1G基因的免疫細(xì)胞簇。scRNA-seq相關(guān)研究表明，在孕早期，巨噬細(xì)胞在人類胎兒腎臟的固有免疫細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，但是從受孕后第9周開始，其他免疫細(xì)胞亞群（包括DC和淋巴細(xì)胞）增加。這些發(fā)現(xiàn)與小鼠研究的數(shù)據(jù)一致，表明腎臟中的組織駐留巨噬細(xì)胞不僅僅源自骨髓衍生的單核細(xì)胞，而且可能在胚胎發(fā)育早期源自胎兒卵黃囊或肝臟的紅髓細(xì)胞前體。

疾病人群的腎臟免疫

腎臟可能會受到許多普遍和嚴(yán)重疾病的影響，包括急性腎臟損傷、腎小球腎炎、上行感染（腎盂腎炎）和癌癥。在每種情況下，免疫系統(tǒng)對病原體或危險信號或惡性細(xì)胞的識別和應(yīng)答都是至關(guān)重要的。此外，在腎移植中，供者來源的組織免疫細(xì)胞群可以被受體細(xì)胞取代，尤其是在排斥反應(yīng)期間。維持性免疫抑制也會影響免疫細(xì)胞的表型、轉(zhuǎn)錄組和功能。

腎活檢在腎病學(xué)診斷中起著核心作用，并且是一種有用的組織來源，可用來研究免疫細(xì)胞群并確定細(xì)胞狀態(tài)和頻率如何隨疾病發(fā)作和進(jìn)展而改變。但是，這種活檢方法僅獲得相對較小的組織樣本，并且僅常規(guī)在外腎皮質(zhì)采樣。然而，許多小組已開始優(yōu)化方法，以使scRNA-seq可以在臨床活檢樣本上進(jìn)行。

狼瘡性腎炎。對腎活檢樣本進(jìn)行scRNA-seq的一項早期工作是使用狼瘡性腎炎患者的腎臟（n=16）和皮膚（n=12）活檢樣本，以及來自健康個體的5個皮膚活檢樣本，生成899個細(xì)胞的數(shù)據(jù)。在上皮細(xì)胞中，研究人員發(fā)現(xiàn)了活動性狼瘡性腎炎患者的腎小管細(xì)胞和皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中I型干擾素標(biāo)記基因的表達(dá)，突顯了使用更容易獲得的皮膚樣本評估系統(tǒng)性疾病的潛在實用性。在這些腎臟樣本中鑒定出的免疫細(xì)胞數(shù)量非常有限，但包括少數(shù)T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞。

研究人員現(xiàn)在正在努力建立狼瘡性腎炎患者腎臟中免疫細(xì)胞的詳細(xì)圖譜，采用測序前富集免疫細(xì)胞的策略。Accelerating Medicines Partnership網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)表明，狼瘡性腎炎患者的腎臟包含豐富的免疫細(xì)胞，包括炎性和吞噬巨噬細(xì)胞、DC、NK細(xì)胞和一系列記憶性T細(xì)胞。一部分B細(xì)胞和漿細(xì)胞（自身抗體的來源）表達(dá)了I型干擾素標(biāo)記基因，表明這些細(xì)胞是疾病發(fā)病機(jī)理的重要參與者。進(jìn)一步的研究可以根據(jù)患者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要特征對患者進(jìn)行分層，并提供對特定B細(xì)胞克隆是否在組織損傷部位延伸的見解。

Accelerating Medicines Partnership網(wǎng)絡(luò)還證明了對尿液樣本中的細(xì)胞（包括免疫細(xì)胞）進(jìn)行scRNA-seq的可行性，提供了以無創(chuàng)方式檢測腎臟免疫細(xì)胞的潛在的手段。Accelerating Medicines Partnership網(wǎng)絡(luò)已嘗試將有關(guān)SLE患者全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）中鑒定的疾病易感基因的信息，與狼瘡性腎炎患者活檢樣本scRNA-seq獲得的細(xì)胞基因表達(dá)信息進(jìn)行整合。同樣，另一項研究將GWAS和其他遺傳研究確定的易感基因映射到小鼠腎臟的scRNA-seq獲得的單細(xì)胞簇的基因表達(dá)譜中，發(fā)現(xiàn)了疾病相關(guān)基因的細(xì)胞類型特異性表達(dá)。因此，該方法提供了一種額外的手段，可以結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)更好地了解構(gòu)成疾病發(fā)病機(jī)理的細(xì)胞亞群。

移植。另一項研究比較了兩個高通量scRNA-seq系統(tǒng)Drop-seq和inDrop從人腎活檢樣本中產(chǎn)生單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的效率。最終，inDrop產(chǎn)生了優(yōu)異的結(jié)果，研究人員隨后對從同種異體移植的急性抗體介導(dǎo)排斥（ABMR）的腎臟活檢樣本中獲得的4487個單細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，并對健康對照腎臟中獲得4259個單細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞核RNA-seq。在同種異體移植樣本中，研究人員鑒定出三個不同的內(nèi)皮細(xì)胞簇，其中兩個似乎被激活，其Fc受體信號通路的上調(diào)與ABMR的診斷相符。免疫細(xì)胞浸潤中存在單核細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和T細(xì)胞，CD16–單核細(xì)胞中的基因表達(dá)模式表明DC細(xì)胞成熟。漿細(xì)胞的存在與供體特異性抗體的局部產(chǎn)生相共存，這具有治療意義。值得注意的是，在這項研究中使用的健康對照腎臟樣本中未鑒定出免疫細(xì)胞。這些細(xì)胞的缺失可能與用于生成這些數(shù)據(jù)的不同平臺有關(guān)，并且采樣的細(xì)胞核數(shù)量相對較少。

腎臟癌。免疫細(xì)胞浸潤也存在于腎臟腫瘤中，但其表型和功能可能會因腫瘤微環(huán)境而改變。免疫細(xì)胞浸潤的程度是RCC患者預(yù)后不良的獨立因素，強(qiáng)調(diào)了腫瘤與免疫細(xì)胞相互作用的重要性。一項研究使用大規(guī)模流式細(xì)胞術(shù)的方法來鑒定RCC中疲憊性和調(diào)節(jié)性的T細(xì)胞，以及各種表達(dá)與腫瘤和抗腫瘤表型相關(guān)的標(biāo)志基因的巨噬細(xì)胞。疲憊性的T細(xì)胞的頻率與CD38⁺腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞的頻率相關(guān)，并與無進(jìn)展生存相關(guān)，這突出了使用單細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步了解腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的免疫情況。我們使用scRNA-seq比較了腎臟腫瘤內(nèi)的細(xì)胞與正常幼兒、成年和胎兒腎臟中腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，并鑒定了可能導(dǎo)致Wilms腫瘤和RCC發(fā)生的細(xì)胞起源。這項研究還揭示了表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）的RCC相關(guān)巨噬細(xì)胞群，其蛋白產(chǎn)物促進(jìn)并成為該惡性腫瘤現(xiàn)代治療方案的靶標(biāo)。這說明scRNA-seq解決腫瘤個體發(fā)育問題的能力，以及確定可能適合藥理學(xué)治療的病理生理機(jī)制和細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的能力。

總結(jié)與展望

單細(xì)胞技術(shù)有望更廣泛地轉(zhuǎn)變我們對免疫學(xué)和人類生物學(xué)的理解。研究人體血液、次級淋巴器官和整個組織（包括腎）產(chǎn)生的數(shù)據(jù)有可能構(gòu)成人類細(xì)胞圖譜的一部分，這是一項國際性的工作，旨在產(chǎn)生不同年齡、健康和疾病的人類細(xì)胞的全面而系統(tǒng)的參考圖譜，供研究人員自由獲取。最終，這種資源將為生物醫(yī)學(xué)研究界研究一系列生物學(xué)問題的細(xì)胞狀態(tài)提供參考。在腎臟病學(xué)中，翻譯潛力是顯而易見的。對腎細(xì)胞異質(zhì)性以及這種異質(zhì)性如何通過發(fā)育和疾病變化將有助于藥物靶標(biāo)的鑒定，并改善脫靶作用的預(yù)測。將單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于臨床腎臟活檢樣本或尿液中的細(xì)胞，將提高腎病學(xué)和移植的診斷準(zhǔn)確性，并有助于個性化預(yù)后。在影響腎臟的全身性自身免疫性疾病中，對外周血和次級淋巴器官的分析將產(chǎn)生相似的見解，并有助于揭示自我耐受性下降的原因和性質(zhì)。最后，在再生醫(yī)學(xué)中，單細(xì)胞分析將使人們能夠更好地了解體外細(xì)胞分化與體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)的比較，從而促進(jìn)組織置換甚至器官的發(fā)育。這些數(shù)據(jù)加在一起，將有可能以類似于人類基因組計劃的方式轉(zhuǎn)化生物學(xué)和醫(yī)學(xué)，從而開創(chuàng)了理解生理和疾病過程的新時代。

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