發(fā)布時(shí)間：2010-12-02
鮑笑嶺 許 旭
摘 要：高效液相色譜整體柱(又名連續(xù)床)具有制備相對簡單、原料易得以及聚合組分在一定范圍內(nèi)可調(diào)節(jié)的優(yōu)點(diǎn)，是近年來得到迅速發(fā)展的新型色譜柱。本文綜述了目前高效液相色譜(HPLC)制備整體柱的典型高聚物體系、制備各種整體柱時(shí)反應(yīng)條件的影響，并簡要介紹了它的表征方法和應(yīng)用。
關(guān)鍵詞： 整體柱，聚合物，高效液相色譜，評述
1 引 言
近年來，高效液相色譜整體柱作為一種新型色譜柱迅速發(fā)展起來。已有數(shù)家公司推出了商品化的整體柱，例如無機(jī)硅骨架的整體柱Silica RODTM、Prep RODsTM和ChromolithTM，有機(jī)聚合物整體柱CIMTM。有關(guān)這一新技術(shù)的綜述也有多篇，但其中討論毛細(xì)管電色譜整體柱的較多。
整體柱(monolithic column)又稱整體固定相(monolithic stationary phasc)、棒柱(rod)、連續(xù)床(continuous bed)等，是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu)，可根據(jù)需要對整體材料的表面作相應(yīng)的衍生化，是一種新型的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔介質(zhì)。通過控制聚合條件來得到具有理想孔徑分布的整體柱。整體柱中的空間由聚合物顆粒中的孔和顆粒間的縫隙組成，分離在樣品流經(jīng)孔結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)生?？梢詼p少路徑的差異和縱向擴(kuò)展。雖然早在1967年Kubin等嘗試用聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯凝膠制備分離蛋白質(zhì)的低壓排阻色譜柱，但實(shí)用性的整體柱是1989年Hjerten首次報(bào)道的聚丙烯酰胺整體柱。整體柱的優(yōu)點(diǎn)包括：可以原位制備，省去制備填料和裝柱，也可以同法制成聚合物顆粒后再裝柱；聚合物易于制備，柱子的長度和直徑在一定程度上不受限制；聚合反應(yīng)混合物中的單體可以靈活選擇以得到合適的基質(zhì)和性質(zhì)；易于在柱衍生化，以得到具有合適性質(zhì)的色譜柱；通過控制聚合反應(yīng)的條件可以優(yōu)化孔的性狀。目前制備的整體柱分為無機(jī)和有機(jī)兩大類：前者主要是將硅氧化物直接燒結(jié)在柱內(nèi)或者用溶膠-凝膠法在柱中反應(yīng)得到，后者則是有機(jī)聚合單體在柱管內(nèi)原位聚合得到的。用作整體柱分離介質(zhì)的多孔高聚物必須考慮其表面的化學(xué)性質(zhì)、對溶劑和溶質(zhì)的保留、孔隙率、孔徑分布和硬度這幾方面的要求。整體柱可以用作高效液相色譜柱和毛細(xì)管電色譜柱，本文主要討論高效液相色譜整體柱的制備。而制備方法差異比較大的分子印跡整體柱詳見文獻(xiàn)。
2 整體柱材料
2.1 無機(jī)整體柱
液相色譜中傳統(tǒng)的填充柱常用硅膠作為填充基體材料，鋯、鈦、鋁的氧化物目前還不太常用。近十幾年發(fā)展起來的無機(jī)整體柱通常利用有機(jī)硅，如四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷，在醋酸水溶液中水解，隨后在制孔劑(如聚乙二醇)存在下制得具有孔洞結(jié)構(gòu)的整體硅膠柱。它比傳統(tǒng)的填充柱有更大的孔和更好的滲透性，可以在較高的流速下保持較低的壓力。
Minakuchi等首先將溶膠-凝膠法應(yīng)用于硅膠整體柱的制備，其步驟是：四甲氧基硅烷的水解(有酸水解和堿水解兩種)；水解的硅四面體結(jié)合，形成Si-O-Si鍵；高溫老化(一般不小于600℃)，使聚合反應(yīng)完全、骨架堅(jiān)硬。利用溶膠-凝膠法制備硅整體柱的難點(diǎn)是整體材料在聚合過程中會收縮。因此，在模具中先制得的整體硅膠柱要截成適當(dāng)長度裝到聚四氟乙烯的柱管中。為了保證柱子準(zhǔn)直，通常內(nèi)徑小于10mm，柱長不超過15cm。聚四氟乙烯包裹的柱子可以耐受高達(dá)120㎏/cm2的壓力。整體材料在模具中聚合時(shí)，因?yàn)橥瑫r(shí)存在整個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)收縮，得到流通孔徑/骨架尺寸比為1.2～1.5，而填充柱中該值為0.25～0.4。
整體硅膠材料和有機(jī)整體材料一樣，可通過化學(xué)修飾或改變原料(使用不同性質(zhì)的聚合單體)獲得不同用途的整體柱。整體硅膠基質(zhì)表面的硅羥基是化學(xué)修飾的靶點(diǎn)。Minakuchi等用十八烷基二甲基-(N，N-二乙基胺基)硅烷與硅羥基反應(yīng)得到用于反相高效液相的C18-整體硅柱。McCallcy比較了傳統(tǒng)的填充柱與Merck公司反相整體硅膠柱分離中性和堿性化合物的情況。實(shí)驗(yàn)顯示，高流速分離中性樣品時(shí)，整體柱的理論塔板高度小于5μm填料填充的色譜柱；酸性條件室溫下高流速分離弱堿性和強(qiáng)堿性樣品時(shí)，板高仍低于填充柱，但拖尾明顯；整體柱在流動相pH為7時(shí)，分離強(qiáng)堿性樣品的峰形更差。柱溫升高會提高溶質(zhì)在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)(Dm)而提高柱效。Massolin等采用Merck公司的整體硅膠氨基柱，以N，N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯為連接臂，制備了青霉素?；D(zhuǎn)移酶的酶反應(yīng)器，并用它研究了2-芳氧基脂肪酸甲酯及其類似物的在線酶催化不對稱反應(yīng)和分離。
2.2 有機(jī)聚合物整體柱
2.2.1 丙烯酰胺類的整體材料 聚丙烯酰胺體系是典型的水相聚合體系，也有在有機(jī)相聚合的報(bào)道。其特點(diǎn)是：單體易溶于水；有良好的生物兼容性，適合分離生物大分子；柱中的凝膠顆粒上沒有孔來增加傳質(zhì)，但其直徑小，表面粗糙，所以表面積大，結(jié)合位點(diǎn)多；凝膠顆粒間靠共價(jià)鍵結(jié)合，流動阻力??；可通過壓緊柱子降低孔體積來提高分離效果；分離效果往往隨流速的提高而提高，表明因擴(kuò)散造成的區(qū)帶展寬減小了。Hjerten等最先利用這一體系制備整體柱。制備聚丙烯酰胺整體柱時(shí)，交聯(lián)劑的比例較高，還要加入硫酸銨以促使相分離，產(chǎn)生供流動相流過的流通孔。1994年， Hjerten等對交聯(lián)聚丙烯酰胺整體柱中流通孔的性質(zhì)如何受聚合反應(yīng)條件的影響進(jìn)行了研究。以甲基丙烯酰胺為單體，哌嗪二丙烯酰胺為交聯(lián)劑(T=15%，C=55.9%)，以硫酸銨作為致孔劑在磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)中聚合。聚合引發(fā)劑為過硫酸銨(APS)，加速劑為N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)。實(shí)驗(yàn)顯示：溫度、緩沖液種類、引發(fā)劑和加速劑的濃度，以及致孔劑的濃度都會影響孔徑的分布。研究發(fā)現(xiàn)，單體總濃度(T)高于35%(m/V)時(shí)連續(xù)床(整體柱)就開始喪失其機(jī)械強(qiáng)度，并導(dǎo)致極高的流動阻力。通過降低引發(fā)劑和加速劑(如APS和TEMED)的濃度來增加聚合物的鏈長，可以部分克服這個(gè)不足。增加硫酸銨的濃度可以進(jìn)一步降低流動阻力，它在單體混合物中的作用是通過增加生成的聚合物鏈之間的疏水相互作用而在凝膠基質(zhì)中形成流通孔。水相聚合的聚丙烯酰胺質(zhì)地軟，且孔徑分布范圍較大。高流速的沖洗可以將柱子壓緊(柱的最終長度大約只有原來的1/10～1/15)，部分提高機(jī)械強(qiáng)度，并減小孔徑分布從而提高柱效。聚合物溶液中加入丙烯酸可以得到陽離子交換色譜柱；加入N-烯丙基二甲基胺可以得到陰離子交換柱，35mm長的陰離子交換柱可以在10min內(nèi)分離5種蛋白質(zhì)，并且分離效果不受流速的影響。細(xì)內(nèi)徑陰離子交換柱(70mm×0.3mm)在30min內(nèi)能完全分離肌紅蛋白、核糖核酸酶A、卵白蛋白、α-糜蛋白酶原、A，R-藻紅蛋白5種蛋白質(zhì)；加入丙烯酸丁酯則可得到疏水相互作用色譜(HIC)柱。Freche等將單體(丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺)溶解于二甲亞砜和醇的混合物中，無須壓柱即可一步制得堅(jiān)硬的整體材料。當(dāng)然，水溶性APS的必須以油溶性的自由基引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)代替。作者將丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)于50℃溶于DMSO與醇的混合物中。除氧后加入AIBN。在60℃水浴中反應(yīng)24h，聚合產(chǎn)物干燥后利用壓汞法測定孔徑。實(shí)驗(yàn)證明孔徑在1000nm左右可以得到合適的流速，同時(shí)柱壓較低?？刂坪线m的聚合條件，如交聯(lián)劑及致孔劑的比例、致孔劑的組成、反應(yīng)速度(由反應(yīng)溫度和引發(fā)劑的濃度決定)，可以得到理想的孔徑。實(shí)驗(yàn)中選用對丙烯酯胺和Bis都有良好溶解能力的二甲亞砜作為致孔劑之一。致孔劑的另一個(gè)組分則要求有長烷基鏈來促進(jìn)相分離。致孔劑的組成和各成分的比例決定了單體可能的濃度和相分離的時(shí)間。致孔劑中，用聚丙三醇時(shí)得到大于1200nm的孔，其中的比例為30%時(shí)得到最大的孔徑。Xie等用甲基丙烯酸丁酯部分代替丙烯酰胺制得HIC柱。改變甲基丙烯酸丁酯在聚合混合物比例(為5%～15%)的實(shí)驗(yàn)顯示，只增加甲基丙烯酸丁酯的含量會使孔徑降低。例如，當(dāng)十二醇為二元致孔劑組分之一，丙烯酰胺2甲叉雙丙烯酰胺整體材料的平均孔徑為550nm，用甲基丙烯酸丁酯完全取代丙烯酰胺后，平均孔徑只有48nm。因此，要用更長鏈的脂肪醇替代十二醇，方可得到合適的流通孔。一旦改變單體的組成或比例就要對致孔劑做出相應(yīng)的調(diào)整。作者用含10%甲基丙烯酸酯柱分離了5種蛋白質(zhì)。
2.2.2 甲基丙烯酸酯類的整體材料 聚甲基丙烯酸酯類整體柱的特點(diǎn)因酯部分的變化而不相同。若酯部分是烷基，疏水程度可由甲基丙烯酸酯的比例和烷基鏈的長度來調(diào)整。酯部分含有環(huán)氧基團(tuán)的整體柱易于衍生化。例如，以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體的聚合物可容易地引入離子基團(tuán)而制備離子交換色譜柱，并且衍生化試劑的選擇范圍也可大大擴(kuò)展。目前，有關(guān)這一體系的報(bào)道主要涉及利用氨基化合物(如乙二胺、肽，甚至是蛋白質(zhì))與環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)，以及酸性條件下環(huán)氧開環(huán)成為二醇等。聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-亞乙基二甲基丙烯酸酯)體系研究最早是Svec等報(bào)道的，該體系的典型制備方法是：單體(甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)：亞甲基二甲基丙烯酸酯(EDMA)=60：40(V/V))與致孔劑(環(huán)己醇：十二醇=90：10(V/V))以40：60(V/V)混合后，加入引發(fā)劑AIBN，通氮除氧后注入不銹鋼柱，在55℃聚合12h。反應(yīng)完成后，將柱子接到HPLC泵上，在45℃用將THF聚合物中的殘余試劑洗出。利用聚合物中的環(huán)氧基團(tuán)，采用兩種衍化方式：(1)泵入0.5mol/L，水浴60℃反應(yīng)3h，這樣得到含二醇官能團(tuán)的多孔聚合物；(2)注入2mL二乙胺，加熱反應(yīng)，得到含1-(N，N-二乙基胺)-2-羥基丙基官能團(tuán)的離子交換色譜柱可分離蛋白。在胺化制備的3根柱中，柱1于55℃下反應(yīng)3h，聚合物的氮含量最高(1.26mmol/L)；柱2于55℃下反應(yīng)1h，氮含量是0.67mmol/L；柱3在20℃下反應(yīng)5.5h氮含量只有0.27 mmol/L 。柱官能團(tuán)含量高，保留時(shí)間長，要用更強(qiáng)的離子強(qiáng)度的流動相才能分開；柱3上的官能團(tuán)過少，分離不好；柱2用離子強(qiáng)度相對較小的流動相就可以分離。
整體材料如果發(fā)生溶脹，不會影響材料的外觀尺寸但會降低孔徑，使柱壓升高。等通過測定苯和聚苯乙烯的保留時(shí)間分別為0.63和0.60min且峰形很銳，說明柱子中沒有明顯的分子排阻現(xiàn)象并且?guī)缀醪缓】?。利用所得的弱陰離子交換色譜柱可以分蛋白質(zhì)，、聚脫氧腺苷酸(12～18個(gè)重復(fù)單位)和聚胸腺嘧啶核苷酸(12～24個(gè)重復(fù)單位)。Hahn等先用十肽與GMA反應(yīng)，再將產(chǎn)物作為單體之一與甲基丙烯酸縮水甘油酯和亞乙基二甲基丙烯酸共聚，制得親和色譜整體柱。羅權(quán)舟等將蛋白質(zhì)用兩種方式連到聚合物上：(1)將制好的基質(zhì)分別與己二胺、戊二醛反應(yīng)，再與蛋白質(zhì)反應(yīng)得到含有11個(gè)碳原子臂的蛋白高效親和色譜柱；(2)將制好的基質(zhì)直接水解，再用新配的高碘酸鈉氧化，最后與蛋白作用制得不含臂的蛋白高效親和色譜柱。實(shí)驗(yàn)證明聚合物基質(zhì)的疏水作用很弱，無臂柱子的非特異性吸附很低。連接臂有一定的非特異性吸附，在流動相中加入15%的乙腈后可以消除疏水作用的影響。合成的蛋白高效親和色譜柱的穩(wěn)定性良好，使用半年后性能基本未發(fā)生改變。衛(wèi)引茂等提高了GMA/EDMA的比值(75/25)，用乙二胺打開環(huán)氧基團(tuán)后再接上氯乙酸，得到弱陽離子交換柱。
2.2.3 聚苯乙烯類的整體材料 聚苯乙烯體系用于離子交換樹脂的制備已經(jīng)發(fā)展得相當(dāng)成熟，優(yōu)點(diǎn)是硬度高且性質(zhì)穩(wěn)定。聚(苯乙烯-二乙烯基苯)整體柱多用于分離蛋白質(zhì)或核酸(單鏈和雙鏈)。Frechet等用所制的聚苯乙烯整體柱還發(fā)展了在柱的沉淀-再溶色譜(。On-Column。 Precipitation-Redissolution Chromatography)，并分離了苯乙烯的寡聚物和高聚物。
制備聚苯乙烯整體柱的方法是：單體(苯乙烯：二乙烯基苯=50：50)致孔劑(癸醇)=40：60。AIBN(1%)加入到混合物中，通氮?dú)獬鹾?，將混合物注入不銹鋼柱子，聚合反應(yīng)在70℃下反應(yīng)24h。然后，除去塞子，將柱子接到HPLC泵上，多孔聚合物中的制孔劑和可溶性物質(zhì)被THF洗出。他們使用了苯乙烯基乙酸酐(styrene acctic anhydride)替代苯乙烯：將二乙烯基苯、苯乙烯基乙酸酐、新型引發(fā)劑2，2，5-trimeth1-3-(1-phenylethoxy)-4-phenyl-3-azahexane、致孔劑(高級脂肪醇和甲苯的混合物)混合均勻并脫氣，灌入柱后油浴下聚合。反應(yīng)結(jié)束后立即用冰水浴冷卻，用THF沖24h后于60℃下真空干燥。他們還討論了反應(yīng)動力學(xué)、孔性狀和制孔劑的影響。Frechet等通過實(shí)驗(yàn)比較了聚苯乙烯整體柱與聚苯乙烯填充柱。在分離結(jié)果相當(dāng)?shù)那闆r下，整體柱的柱壓低，流速-柱壓的線性范圍約為填充柱的10倍；提高流速，整體柱的分離效果不會變差。與無機(jī)整體材料相比，有機(jī)整體材料可以一步制得，但聚合過程中整體材料存在縱向收縮，即在柱頭或柱尾產(chǎn)生空隙。這個(gè)問題可以通過向聚合混合物中加入已聚合好的微粒，或進(jìn)行二次聚合來解決。在使用過程中，有機(jī)整體材料可能會隨著流動相的改換而發(fā)生可逆的溶脹和收縮，從而改變柱壓；聚合溫度提高、反應(yīng)時(shí)間延長以及減少制孔劑的用量都可以提高聚合物的機(jī)械強(qiáng)度。使用短而粗的柱子也可以減少壓力的負(fù)面影響；無機(jī)材料整體柱的制備較為煩瑣，周期較長。聚合過程中整體材料是橫向收縮，通常在模具里制成后再裝到管套中。與有機(jī)相整體柱相比，整體硅膠柱的物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在使用過程中流動相的選擇范圍廣，硅骨架的硬度高，不會出現(xiàn)使用過程中柱子被壓縮的現(xiàn)象。
3 整體材料的性質(zhì)評價(jià)及性狀控制
3.1 評價(jià)整體柱的參數(shù)
評價(jià)整體材料的參數(shù)主要包括：孔徑分布、比表面積和孔隙率。多孔整體材料中孔徑分布可以用壓汞法測定，或由掃描電鏡觀察到。盡管這兩種方法是在材料干燥后測定的，與柱子實(shí)際運(yùn)行的狀態(tài)不同，但是柱子。干。時(shí)和。濕。時(shí)的孔徑存在著嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系[8]。通過逆體積排阻色譜(ISEC)可以測定整體柱于溶脹狀態(tài)下的孔徑分布。但是， ISEC的有效應(yīng)用范圍受制于標(biāo)準(zhǔn)樣品的尺寸，因?yàn)榧词故菙?shù)百萬分子量的樣品也無法測定100nm以上的孔。比表面積可以用氮?dú)馕?解吸法來測定，也是測定柱子。干。時(shí)的狀態(tài)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)可用紅外光譜法測定，尤其是在合成好的基質(zhì)上接上衍生化基團(tuán)后，可以方便地觀察到特征峰的變化?？梢杂迷胤治鰜頊y定衍生化基團(tuán)的含量。如果采用先將單體衍生化再進(jìn)行聚合反應(yīng)的方法，可用來NMR分析官能團(tuán)的變化。
3.2 孔徑的控制
Frechet等認(rèn)為多孔聚合物的形成過程與致孔劑、單體和生成的聚合物三者的極性有關(guān)：致孔劑與單體的極性接近，才能作為單體的良溶劑。致孔劑極性與聚合物極性的差異越大，相分離越早出現(xiàn)，則聚合物孔徑越小。但相分離出現(xiàn)得過晚，孔徑也小?？讖降拇笮∮删酆戏磻?yīng)混合物中交聯(lián)劑和致孔劑的比例、組成以及由反應(yīng)溫度和引發(fā)劑種類和濃度決定的反應(yīng)速度等聚合反應(yīng)的條件決定。由于改變混合物中交聯(lián)劑的比例會改變聚合物的化學(xué)組成，增加致孔劑的比例會增加孔體積并降低硬度，結(jié)果只有致孔劑的組成和反應(yīng)速度(受溫度、引發(fā)劑種類和濃度的影響)常被用來調(diào)整孔徑。使用致孔劑通常要遵循以下的原則：(1)致孔劑體系要能在低于或等于聚合反應(yīng)溫度下完全溶解單體混合物；(2)致孔劑對于單體和柱子而言是惰性的，并易除去；(3)致孔劑的比例應(yīng)使聚合反應(yīng)產(chǎn)生合適的相分離。
3.3 整體柱的骨架結(jié)構(gòu)對其色譜行為的影響
在不影響骨架的前提下，整體柱中孔徑的大小可以控制，這使整體柱的流動阻力和擴(kuò)散比填充柱小很多。對于傳統(tǒng)的填充柱，表觀壓力降與填料的孔結(jié)構(gòu)可以用Kozeny-Carman方程式表示：Usf＝(1/Kva2)(Δp/ηL)ε，其中Usf為表觀流速，K為填料的形狀因子，a為填料的比表面積)聯(lián)系起來。該等式在空隙度(porosity) ε為0.4左右(填充柱的通常值)與實(shí)際情況符合較好，而整體柱的ε可達(dá)0185，這時(shí)該方程就不能直接使用了。 Liapis等根據(jù)整體柱的微觀細(xì)節(jié)建立相應(yīng)的網(wǎng)狀模型，但未考慮到對表觀流動阻力貢獻(xiàn)顯著的垂直于骨架的前沿流。 Vervoor和Gzil等利用相關(guān)軟件提出四面體骨架模型，從而建立了表觀的壓力降與整體硅膠柱特定孔結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。
3.4 整體材料表面的衍生化
液相色譜整體材料的衍生化主要為聚合后衍生，即單體先聚合成基質(zhì)再接上特定的官能團(tuán)。如聚丙烯酸縮水甘油酯類聚合物因?yàn)楹协h(huán)氧基團(tuán)就可以方便地用于衍生化。使用聚合后衍生方式，基質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不變，聚合反應(yīng)條件不用重新摸索，但在柱衍生化條件不能過于劇烈。
4 整體柱的應(yīng)用
Zou等在綜述中詳細(xì)討論了整體柱的應(yīng)用。生物大分子或聚合物的分離多見于有機(jī)聚合物骨架的HPLC整體柱，而小分子的分離一般見于硅骨架的整體柱和有機(jī)聚合物骨架的CEC整體柱。其原因可能是原位聚合得到的整體柱總會存在一定的孔徑分布，以方式分離小分子時(shí)，擴(kuò)散嚴(yán)重，柱效差。而用于HPLC的硅整體柱分離小分子的優(yōu)勢，原因可能與骨架硬度高和流速高有關(guān)。
(1)離子交換色譜柱 聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-亞乙基二甲基丙烯酸酯)整體柱用乙二胺衍生化得到陰離子交換色譜柱，分離溶菌酶、大豆胰島素抑制劑(Soybean Trypsin Inhibitor)和伴白蛋白(Conalbum in)等蛋白質(zhì)，也可以分離聚脫氧腺苷酸(12～18個(gè)重復(fù)單位)和聚胸腺嘧啶核苷酸(12～24個(gè)重復(fù)單位)。衛(wèi)引茂等將氯乙酸接到胺化好的柱子上得到弱陽離子交換柱，可用于分離5標(biāo)準(zhǔn)蛋白。(2)親和色譜柱 羅權(quán)舟等將蛋白質(zhì)A連到聚合物上得到蛋白高效親和色譜柱分分析了人IgG和BSA。Hahn等用一個(gè)十肽先與甲基丙烯酸縮水甘油酯反應(yīng)，再與甲基丙烯酸縮甘油酯和亞乙基二甲基丙烯酸共聚，制得親和色譜整體柱用于溶菌酶的分析。(3)疏水相互作用色譜 Xie等用甲基丙烯酸丁酯部分代替丙烯酰胺制得的HIC柱分離了5種蛋白質(zhì)。(4)體積排阻色柱 聚丙烯酰胺整體柱多用做體積排阻色譜柱，在30min內(nèi)能完全分離肌紅蛋白、核糖核酸酶A、卵白蛋白、α-糜蛋白酶原、A、R-藻紅蛋白五種蛋白質(zhì)，還可以分離多肽和。(5)生物反應(yīng)器 酶固定在整體柱上，可以得到生物反應(yīng)器。 Massolin等利用Merck公司的整體硅膠氨基柱制備了霉素?；D(zhuǎn)移酶的酶反應(yīng)器，并利用它研究了一些2-芳氧基脂肪酸甲酯及其類似物的在線酶催化對稱反應(yīng)和分離。(6)反相色譜柱 將C18等疏水基團(tuán)引入整體柱中，得到反相色譜柱。
5 結(jié)論及展望
整體柱原位聚合不僅省時(shí)省力，還意味著柱子不必受裝柱技術(shù)和填料的限制。相對于填充柱，整柱的空隙率較高，柱壓低，使快速的分離分析和制備成為可能。有機(jī)相整體柱存在因流動相變會發(fā)生溶脹或收縮、機(jī)械強(qiáng)度差、比表面積小、柱容量差以及聚合過程中產(chǎn)生的微孔不利于小分子樣的分析等問題，現(xiàn)有報(bào)道大都用于生物大分子的分離。硅骨架整體柱也存在必須預(yù)先聚合好裝入套管中，制備繁瑣，比表面積較小的問題。對這些問題的研究將使整體柱得到新的發(fā)展。
