2020年10月，來自弗吉尼亞理工大學(xué)弗林生命科學(xué)研究所的Finkielstein課題組與阿根廷國立基爾梅斯大學(xué)的Golombek課題組在Science Advance上發(fā)表了題為“Circadian disruption promotes tumor-immune microenvironment remodeling favoring tumor cell proliferation” 的文章，該研究以黑色素瘤小鼠為模型闡述了慢性晝夜節(jié)律紊亂對腫瘤免疫微環(huán)境重塑和腫瘤生長的影響^[1]。

——背景——

晝夜節(jié)律也就是生物鐘是自然界中的有機(jī)體在長期進(jìn)化過程中形成的一種近似24小時(shí)的節(jié)律性規(guī)律。在哺乳動(dòng)物中，生物鐘由正向轉(zhuǎn)錄因子Clock和Bmal1，負(fù)調(diào)控因子Per和Cry組成的轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路所調(diào)控，以此維持機(jī)體生理行為的節(jié)律性（例如，睡眠、發(fā)育、免疫和代謝等）。全基因組轉(zhuǎn)錄譜分析表明，約10%的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，包括參與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換、DNA損傷和細(xì)胞死亡過程的基因，都處于晝夜節(jié)律控制之下，因此生物鐘影響了細(xì)胞的分裂、分化、衰亡等生命歷程^[2]。最近流行病學(xué)的研究將癌癥與生物鐘紊亂聯(lián)系在了一起，長期輪班工作或者跨時(shí)區(qū)飛行的人群具有更高的癌癥易感性，生物鐘網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起到了十分關(guān)鍵的作用^[3]，因此在本文中作者對慢性時(shí)差與癌癥易感性之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，揭示了晝夜節(jié)律紊亂促進(jìn)腫瘤增殖的分子生物學(xué)機(jī)制。

——結(jié)果——

為了研究慢性時(shí)差所帶來的生物鐘紊亂對腫瘤增殖的影響，作者構(gòu)建了節(jié)律正常和慢性時(shí)差的小鼠模型，即LD組：正常的光暗條件LD12:12（白天12小時(shí)黑暗12小時(shí)），CJL組：每隔兩天光暗周期前移6h（類似于人的跨時(shí)區(qū)飛行），使兩組小鼠分別在該環(huán)境中適應(yīng)三周，隨后皮下接種黑色素瘤B16細(xì)胞，比較節(jié)律正常與節(jié)律紊亂小鼠的腫瘤增殖速率。令人驚訝的是，與LD組相比，CJL組小鼠腫瘤增殖速度顯著增加（圖1A），并且有著更高的致死率（圖1B），除此之外，腫瘤的潛伏期也更短，大約15天左右即可在小鼠內(nèi)成瘤（圖1C）。

圖1. 在LD和CJL條件下接種黑素瘤細(xì)胞系B16小鼠的腫瘤大?。ˋ），存活率（B）和腫瘤潛伏期（C）。

由于腫瘤免疫微環(huán)境對于腫瘤的生長至關(guān)重要，作者猜測晝夜節(jié)律紊亂可能會影響腫瘤微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞的比例，使之有利于腫瘤的增殖，接下來作者檢測了24小時(shí)中4個(gè)不同時(shí)刻（白天（ZT3、ZT9），夜間（ZT15、ZT21））小鼠腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的百分比，總巨噬細(xì)胞的比例在兩組小鼠間沒有明顯差異，但有趣的是，M1和M2兩種巨噬細(xì)胞在不同時(shí)刻的水平發(fā)生了顯著變化，CJL組小鼠M1腫瘤浸潤的巨噬細(xì)胞在白天和夜間的水平被逆轉(zhuǎn)，白天處于更高的水平（圖2A），而M2巨噬細(xì)胞在白天的水平也出現(xiàn)了顯著降低，并且節(jié)律性喪失（圖2B），M1/M2的比例出現(xiàn)了相位逆轉(zhuǎn)并且在夜間水平出現(xiàn)了明顯降低（圖2C）。而在腫瘤發(fā)生的過程中，M1型巨噬細(xì)胞具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而M2型巨噬細(xì)胞卻能促進(jìn)腫瘤的生長、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，這些表明，CJL組小鼠的免疫微環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐?/span>M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制為主的狀態(tài)。隨后，作者又繼續(xù)檢測了腫瘤中炎性細(xì)胞因子白介素-1β和白介素-6（IL-1β和IL-6）和腫瘤壞死因子-α的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1β和IL-6的節(jié)律性振蕩在CJL組小鼠中大幅減弱（圖2D,E）。而TNF-α雖然在每日周期中保持著不同的表達(dá)水平，CJL組小鼠的振蕩模式相較于LD組處于一種反相狀態(tài)（圖2F）。以上結(jié)果都表明，晝夜節(jié)律破壞會誘導(dǎo)腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)生重要變化，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的生長。

圖2. 慢性時(shí)差（CJL）對腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞與細(xì)胞因子的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測到的腫瘤組織樣本中M1型巨噬細(xì)胞（A）和M2型（B）M1型/M2型百分比（C）ELISA測定的腫瘤組織樣品中IL-1β（D），IL-6（E）和TNF-α（F）的蛋白質(zhì)水平。

為了進(jìn)一步揭示宿主生物鐘對腫瘤生長的影響，作者檢測了小鼠外周組織肝臟中核心生物鐘基因Bmal1和Cry1的振蕩表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LD組小鼠Bmal1和Cry1的mRNA表達(dá)水平具有節(jié)律性的振蕩，而CJL組小鼠的表達(dá)模式相較于LD組有很大差別，節(jié)律性振蕩減弱，表明肝臟晝夜節(jié)律發(fā)生了改變（圖3）。

圖3. 小鼠肝臟中Bmal1（A，C）和Cry1（B，D）的mRNA表達(dá)水平。

接下來作者也檢測了腫瘤組織中生物鐘基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在LD組和CJL組小鼠中，Bmal1和Cry1基因的表達(dá)均未顯示出節(jié)律性（圖4），腫瘤組織中的生物鐘是被破壞的，這也暗示生物鐘控制基因（涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝等）的失調(diào)，促使細(xì)胞失控進(jìn)一步惡化無限增殖。

圖4. 小鼠腫瘤組織中Bmal1（A，C）和Cry1（B，D）的mRNA表達(dá)水平。

——小結(jié)——

本文發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律的破壞可以通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來促進(jìn)腫瘤的生長。當(dāng)晝夜節(jié)律紊亂時(shí)，腫瘤免疫應(yīng)答的晝夜節(jié)律模式發(fā)生了改變，在CJL小鼠中，M1型細(xì)胞（和M1/M2比率）的減少將使穩(wěn)態(tài)平衡朝著更具有耐受性的免疫特征發(fā)展，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸和腫瘤發(fā)生發(fā)展。并且CJL組小鼠的生物鐘基因表達(dá)模式也發(fā)生了紊亂，從而引發(fā)下游鐘控基因的失調(diào)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本文在一定程度上解釋了慢性時(shí)差人群腫瘤高發(fā)生率的原因，并說明生物節(jié)律在腫瘤的治療中有很大影響，時(shí)鐘療法或許是未來癌癥治療的一個(gè)新方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Aiello I. et al. Circadian disruption promotes tumor-immune microenvironment remodeling favoring tumor cell proliferation. Sci Adv. 2020 Oct 14;6(42):eaaz4530.

Doi:10.1126/sciadv.aaz4530.

[2] Takahashi J.S. et al. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 2017 Mar; 18(3):164-179.

Doi:10.1038/nrg.2016.150.

[3] Golombek D. A. et al. The times they're a-changing: effects of circadian desynchronization on physiology and disease. J Physiol Paris. 2013 Sep;107(4):310-22.

Doi:10.1016/j.jphysparis.2013.03.007.