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文章信息

題目：Gene Editing to Accelerate Crop Breeding

刊名：Frontiers in Plant Science

作者：Kanwarpal S. Dhugga

單位：International Center for Maize and Wheat Improvement (CIMMYT), El Batan, Mexico

日期：27 May 2022?

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摘要

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主要內(nèi)容

2.1 基因編輯可以縮短產(chǎn)品開發(fā)時間并消除產(chǎn)量阻力

通過基因工程引入無法獲得足夠自然變異的性狀，被證明在防治害蟲和雜草方面有效（Rafalski，2017）。然而，轉(zhuǎn)基因作物的好處主要由發(fā)達國家的農(nóng)民實現(xiàn)（Klümper和Qaim，2014）。種子的成本和消費者對轉(zhuǎn)基因作物的抵制使它們無法進入發(fā)展中國家，特別是非洲（Rafalski，2017）。

現(xiàn)代技術(shù)已經(jīng)使人們有可能加快對遺傳簡單性狀的改良，這些性狀由單個或少數(shù)基因控制或影響，而不必擔心轉(zhuǎn)基因作物。

基因編輯領(lǐng)域經(jīng)歷了幾個階段，從20世紀80年代的寡核苷酸介導(dǎo)的編輯開始（Carroll，2017）。其采用的主要障礙是編輯事件的頻率較低（Zhu等人，19992000）。一種相對較新的技術(shù)，即簇狀規(guī)則散布的短回文重復(fù)序列（CRISPR）和CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9），稱為CRISPR-Cas9，由于其易于使用、特異性和高成功率，已經(jīng)徹底改變了基因編輯領(lǐng)域（Svitashev等人，2015）。

CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯已經(jīng)被用于突變基因，或者通過在引導(dǎo)RNA靶向的精確位點處的雙鏈斷裂后的自發(fā)非同源末端連接（NHEJ），或者通過同時使用兩個引導(dǎo)RNA分子的基因缺失。這被稱為定點核酸酶情景-1（SDN1）（Podevin等人，2013；Savitashev等人，2015）。另外兩種情況，SDN2和SDN3，分別涉及模板介導(dǎo)的核苷酸變化和基因或DNA片段插入基因組。

最近的評論中列出了大量在作物中使用CRISPR-Cas系統(tǒng)進行基因編輯的例子（Schenke和Cai，2020；Tiwari等人，2021）。我在后續(xù)章節(jié)中討論的大部分內(nèi)容都與通過將高價值性狀直接引入精英系來加速品種改良有關(guān)（Gao等人，2020）。

為了通過基因編輯證明基因變體的效果，大多數(shù)已發(fā)表的作物報告中都使用了較老的實驗系，這顯然是因為很難直接轉(zhuǎn)化優(yōu)良品種（Schenke和Cai，2020；Tiwari等人，2021）。將新創(chuàng)造的性狀從試驗品系轉(zhuǎn)移到優(yōu)良品種需要雜交和回交，這就否定了基因編輯在縮短產(chǎn)品開發(fā)時間和消除產(chǎn)量拖累方面的優(yōu)勢。

直接在優(yōu)良品種中編輯基因，就不需要回交了（圖1）。在將編輯過的植物自花授粉或異交給具有相同遺傳組成的未編輯植物后，同時使用高度敏感的分子工具對基因組中的任何意外變化進行篩選，確保編輯后的植物中不存在載體骨架的元素（Zastrow-Hayes等人，2015）。根據(jù)我的同行們的說法，通過基因編輯產(chǎn)生的傳統(tǒng)育種獲得的相同性狀的商業(yè)化，在后一種情況下，將改良品種的上市時間縮短了約三分之二（圖1）。作為品種開發(fā)最昂貴的組成部分之一，田間資源的節(jié)省與節(jié)省的時間成正比；與正向育種相比，基因編輯植物只需2-3代而不是5-6代即可商業(yè)化。

Fig. 1

2.2 優(yōu)秀品種基因編輯的瓶頸正在克服

最近，通過在轉(zhuǎn)化載體中包含細胞形態(tài)發(fā)生基因，已經(jīng)克服了直接轉(zhuǎn)化優(yōu)良品種的障礙（Lowe等人，2016，2018a，2018b；Debernardi等人，2020）。在玉米中，將細胞形態(tài)發(fā)生基因包含在轉(zhuǎn)化載體中并對其表達進行微調(diào)，使得可以非常高效地直接轉(zhuǎn)化優(yōu)良品種（Lowe等人，20162018a）。同樣，通過在轉(zhuǎn)化載體中加入生長調(diào)節(jié)因子及其輔因子，小麥的轉(zhuǎn)化效率顯著提高（Debernardi等人，2020）。之前發(fā)表的最常用的方案在不同的實驗室中工作不一致（Ishida等人，2015）。最近在高效轉(zhuǎn)化方面的進展為直接在精英系中編輯基因鋪平了道路，至少在主要作物中如此。

在與Corteva農(nóng)業(yè)科學(xué)公司的合作下，我們在CIMMYT以近乎完美的效率成功地改造了熱帶玉米的優(yōu)良品種。這為直接在商業(yè)生產(chǎn)線中使用基因編輯方法打開了大門。

2.3 可通過基因編輯改善的作物性狀沒有缺失

抗病性和谷物生物強化是基因編輯有助于加快作物改良的兩個領(lǐng)域。其他一些特定于不同作物的特性也可以通過基因編輯來改善。

①小米粉中的酸敗是由脂肪酶釋放的不飽和脂肪酸氧化引起的，限制了其保質(zhì)期。通過解決脂肪酸形成和甘油三酯水解中的幾個定性步驟，它可能會減少。抑制脂肪酸去飽和酶（FAD2），特別是在種子中將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸，顯著增加了油中油酸的比例。

由于FAD2中的突變體具有多效性作用，因此該基因可能被證明是通過敲除珍珠小米來減少酸敗的挑戰(zhàn)。另一種選擇是用在種子中不表達或低水平表達但在其他組織中正常表達的FAD2天然啟動子替換FAD2。脂肪酶在將谷物磨成面粉后從甘油三酯中釋放脂肪酸，是減少珍珠小米酸敗的替代目標。

②獨腳金是一種專性根寄生雜草，影響亞洲和非洲半干旱熱帶地區(qū)的玉米和高粱生產(chǎn)，特別是在貧氮土壤中。它的種子只有在感受到宿主根分泌的信號時才會發(fā)芽。參與形成特定類型獨腳金內(nèi)酯的單個基因突變顯著提高了高粱的獨腳金抗性。它可以通過基因編輯直接產(chǎn)生，而不是將這種突變基因回交到其他優(yōu)良品種中。

③銹病對小麥作物的影響比任何其他疾病都大。每年約有五分之一的小麥作物死于疾病。編輯單個或少數(shù)基因可以顯著提高小麥對白粉病和銹病等真菌病的抗性。一旦抗病能力減弱，就必須引入新的抗病基因?？共』虻膩碓赐ǔ４嬖谟谝吧蜻z傳差異的材料中。

歸因于抗性（R）基因的宿主抗性是由宿主的超敏反應(yīng)引起的，這種反應(yīng)殺死了感染細胞周圍的細胞，從而限制了病原體的傳播。這些基因通常參與細胞信號傳導(dǎo)。然而，這種類型的抗性往往會隨著時間的推移而減弱，需要引入新的抗性來源，再次需要回交到受體系。相反，非宿主抗性涉及代謝或轉(zhuǎn)運蛋白。它允許病原體以緩慢的速度生長，但不會顯著影響谷物產(chǎn)量。它也被稱為持久抗性或成株抗性（APR）。此外，APR基因賦予了對廣譜真菌病原體的抵抗力。由于其耐久性，育種家更喜歡APR而不是宿主抗性，并已將其納入其育種計劃。

小麥SDN1編輯的另一個目標是對白粉病的抗性，該抗性由顯性抗性抑制基因mildew Locus O（MLO）控制。必須敲除所有三個同源等位基因才能賦予抗性。Li等人（2022）事實上成功地在精英系中的所有三個基因座中直接產(chǎn)生突變，這可以在其他易感商業(yè)品種中復(fù)制。通過敲除富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白，可以將小麥對赤霉病的抗性直接引入到優(yōu)良品種中。

玉米致死性壞死（MLN）是一種病毒性疾病，從十年前開始席卷肯尼亞，并蔓延至鄰國，破壞了作物生產(chǎn)。CIMMYT確定了一個強大的QTL，提供了對MLN的定性抗性。QTL是完全隱性的，存在于一個與非洲種質(zhì)無關(guān)的外來品系中。該QTL的強度如圖2所示，其中用MLN接種了具有或不具有QTL的同一自交系。隨著該QTL向漸滲的正向育種的繼續(xù)，我們也對其進行了精細的定位，并正在通過基因編輯來識別致病基因。一旦確定，該基因可以直接在易感精英系中被敲除，這可以在2-3年內(nèi)逆轉(zhuǎn)，而不是回交的7–8年。

Fig. 2

將除草劑耐受性直接編輯到品種中有助于減少非洲婦女的苦力，因為她們必須手動清除作物中的雜草。然而，小農(nóng)能否負擔得起除草劑仍然是一個問號，因此這種特性的滲透性仍然不確定。

谷物生物強化對于發(fā)展中國家兒童的正常發(fā)育至關(guān)重要，因為缺乏微量營養(yǎng)素和維生素會導(dǎo)致發(fā)育缺陷。植酸螯合二價陽離子，防止它們被消化系統(tǒng)吸收。育種群體中谷物植酸的雙重變化表明，有可能在現(xiàn)有遺傳變異范圍內(nèi)提高二價陽離子可用性

通過基因編輯，以磷酸化肌醇的酶為目標，可以減少玉米中的谷物植酸。同樣的方法可以用于減少已經(jīng)上市的商業(yè)品種中的植酸，特別是針對鐵和鋅含量增加的品種。同樣，玉米和其他谷物中的維生素A原可以通過敲除將底物轉(zhuǎn)移至其他反應(yīng)的基因以及氧化β-胡蘿卜素的基因來改善（Sestili等人，2019）。

由于多酚氧化酶（PPO）活性，小麥粉面團變黑。同樣，去皮的土豆如果暴露在空氣中會變成棕色。基因編輯已被用于敲除馬鈴薯中的PPO基因，從而減少褐變。我們正在小麥中使用類似的方法來延長面團的壽命。

2.3 基因編輯在作物改良中的前景（SDN1、SDN2或SDN3）

同源性定向修復(fù)（SDN2）、啟動子交換和等位基因替換或插入（SDN3）已在作物中成功。然而，編輯事件的頻率較低，這在轉(zhuǎn)化是一個挑戰(zhàn)的作物中仍然較低，并且需要進行廣泛的篩選以確定目標變化，這將限制這些方法對高價值性狀的使用。圖2顯示了大效應(yīng)、高價值QTL的一個例子。這些障礙阻礙了現(xiàn)有基因編輯技術(shù)的廣泛采用。此外，SDN3衍生事件將引發(fā)更多的監(jiān)管審查。正如迄今為止的情況一樣，通過SDN1進行的基因編輯很可能會繼續(xù)主導(dǎo)商業(yè)種質(zhì)中的性狀改良，其次是限制SDN2和SDN3的使用，以獲得有理由投入額外資源的性狀。

直接對優(yōu)良品種（主要是SDN1）產(chǎn)生重大影響的基因編輯已經(jīng)在進行中，這將有助于加快作物改良。不缺乏由單個基因控制的高價值性狀，這些基因的期望變體可以使用SDN1復(fù)制，從而消除了與傳統(tǒng)植物育種無法完全去除的殘留供體基因相關(guān)的多效性效應(yīng)。

03

結(jié)論

正向育種對于作物改良是不可或缺的，特別是對于復(fù)雜性狀和壓力環(huán)境，這是一個資源密集和耗時的過程?；蚓庉嬒鄬τ趥鹘y(tǒng)育種的優(yōu)勢很明顯。

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獲取原文

原文鏈接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.889995/full

END

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