文章轉(zhuǎn)自英格恩生物技術(shù)博客!
前些時間有微友在平臺上咨詢細(xì)胞轉(zhuǎn)染的事項,并對一篇博客文章《為什么磷酸鈣轉(zhuǎn)染并不穩(wěn)定?為什么磷酸鈣轉(zhuǎn)染并不經(jīng)濟(jì)?》比較感興趣。在這里,對這位微友的疑惑進(jìn)行更加全方位的了解,在此將磷酸鈣轉(zhuǎn)染的原理和步驟和大家分享,以供交流討論。
核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時,可使 DNA 附在細(xì)胞表面,這有利于細(xì)胞吞入攝取核酸,或通過細(xì)胞膜脂相收縮時裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),進(jìn)入細(xì)胞的DNA,僅有1%~5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中,其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞 DNA 整合,在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá),基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4,這項技術(shù)可以用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物進(jìn)行暫時性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究。該方法往往被用于貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
試劑的配制
(1)2×HBS 1.63 g NaCl ; 1.19g Hepes; 0.023 g Na2 PO4 ·2H2 O; 加水至100 ml pH 7.1 過濾,4℃保存
(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌
(3)TE:0.1mmol/L EDTA,1mmol/L Tris-HCL PH 8.0
(4)G418(新霉素G418)液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2 O至10mL過濾除菌4℃保存。
(5)G418選擇培養(yǎng)基:用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418,G418濃度為200~ 800mg/L
注意:對受體細(xì)胞先做預(yù)試驗,選用濃度為在10~14天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的最低濃度。
操作步驟
(1)供體DNA制備:方法按前介紹的DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L。
(2)受體細(xì)胞的培養(yǎng):研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等,該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向,一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞,接種密度為2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液,37℃、5%CO2 培養(yǎng),待細(xì)胞占50~70%瓶底面積時,用于轉(zhuǎn)染試驗。
(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備
①將供體細(xì)胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同時向供體細(xì)胞DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1~2mg/L的使用量)。
②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中,緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混勻30秒。
③然后立即混旋,室溫下靜置30分鐘,待溶液輕度混濁后,吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。
(4)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞
①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50~70% 的受體細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基,每瓶5ml(25ml培養(yǎng)瓶)。
②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀,加入含5mL培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻。
③置37℃ 5% CO2 培養(yǎng)24h或更長,使細(xì)胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。
④更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。
⑤更換濃度 800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞。
⑥培養(yǎng)大約3~5天,對照細(xì)胞大部分死亡,這時轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基,每3~4天更換一次選擇培養(yǎng)基。
⑦ 2 周后,對照細(xì)胞死亡,在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見有抗藥性的細(xì)胞克隆出現(xiàn),待其增大后再進(jìn)行化和擴(kuò)大培養(yǎng),可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株,并做進(jìn)一步鑒定。
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