Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。
大腸桿菌CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備
1．劃線接種受體菌（DH5α或DH10B）于平板過(guò)夜，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)
過(guò)夜（約16小時(shí)）；
2．取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)
（250-300 rpm）至OD約0.5；
3．將菌液放在冰水混合物中搖晃冷卻10分鐘；
4．4℃下2500 g離心5分鐘；棄上清，加入100 ml預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液重新懸浮細(xì)胞，在冰
上放置20分鐘；
5．4℃下2500 g離心5分鐘；去上清，加入100 ml預(yù)冷0.1M CaCl2溶液在冰上使細(xì)胞重新懸?。?/div>
6．4℃下2500 g離心5分鐘；最后一次盡量倒干凈， 加入1ml預(yù)冷0.1 M CaCl2溶液重懸細(xì)胞，
50~100 ul/管分裝，液氮速凍后存于-80 ℃ 。
1、所用器具的潔凈程度：no detergents
2、培養(yǎng)基的裝量：1/10 ~ 1/5培養(yǎng)瓶容積。
3、培養(yǎng)基的pH值：接種前的pH值在6.8-7.2；菌搖好后不低于6.0。 4、培養(yǎng)后的OD值：0.4~0.6
5、培養(yǎng)溫度：較低的溫度18 ℃ ~22 ℃培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成。
6、加入DMSO保存感受態(tài)細(xì)胞。 7、液氮速凍后保存于超低溫冰箱內(nèi)。
熱激轉(zhuǎn)化
1. 取100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入2-5 ul 重組DNA連接液，混勻；
2. 冰浴放置半小時(shí)；
3. 在42℃保溫 90 s；
4. 快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘；
5. 加入1 ml 新鮮SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，于37℃ 60 rpm
培養(yǎng)1小時(shí)；
6. 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。
電擊轉(zhuǎn)化
將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化
儀的樣品杯中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用
下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分
子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
轉(zhuǎn)化效率：
Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 106 - 108
/ mg DNA
電穿孔轉(zhuǎn)化 108 - 1010 / mg DNA
電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備
1、 -80℃冰箱保存的菌種在SOB固體平板上劃單菌落；
2、次晨，挑選單克隆感至內(nèi)含1 ml SOB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，300 rpm，6 hr； 3、然后轉(zhuǎn)接到含400 ml SOB液體培養(yǎng)基的2L搖瓶中（按1:500的量轉(zhuǎn)接），300 rpm，
4hr，然后每隔10 min測(cè)一次OD600，至OD600=0.55； 4、立刻置冰水浴中驟冷，在冰水混合里旋動(dòng)內(nèi)有培養(yǎng)物的三角瓶；
5、隨后在250 ml預(yù)冷的離心杯中離心，4℃，2000 g，10 min； 6、棄上清后，用預(yù)冷的滅菌重蒸水洗，2200 g，10 min，棄上清；
7、用預(yù)冷的10%的甘油同樣方法再洗兩次，2400 g，10 min； 8、最后一次盡量倒干凈甘油，用殘存在管底的甘油懸浮細(xì)胞，冰上分裝每100μl到
預(yù)冷過(guò)的Ep管中，液氮速凍后保存在-80℃冰箱。
每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于
在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，
因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞
接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體
細(xì)胞不長(zhǎng)）。
單位： CFU（colony forming unit）
例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有
1 08個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3. 4X1011個(gè)分子
（6.02X1017 / 2686X660），也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子才有一
個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。 1ng pUC18轉(zhuǎn)化100ul感受態(tài)細(xì)胞，加入900ul培養(yǎng)基復(fù)蘇1小時(shí)后取
10ul涂板，1000 colonies(=1000ng*1000 colonies*1000ul/10ul)=108,
100 colonies=107, 10 colonies=106
轉(zhuǎn)化效率的用途
利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。例如，某一DNA重
組實(shí)驗(yàn)的重組率為80%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率一般要比
天然的載體低100倍。欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？
若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：
104/107 X 102 = 0.1 mg 載體DNA
考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為80%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：
0.1 / 80% = 0.125 mg 載體DNA
載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按比例算出，還可以估算涂布量。
轉(zhuǎn)化率的影響因素
載體本身的性質(zhì)：
不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同。
載體的空間構(gòu)象：
質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于
空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低
兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
插入片段的大?。?/div>
對(duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。
商品化感受態(tài)細(xì)胞
超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞：Stratagene提供多種>5 x 109 轉(zhuǎn)化子/μg 超螺旋
DNA轉(zhuǎn)化效率的化學(xué)法超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，適合克隆獲得大質(zhì)粒、連接
DNA克隆和建庫(kù)時(shí)使用。
電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞：Stratagene的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞耐受電擊處理，
在DNA材料極珍貴、量少時(shí)、或構(gòu)建有代表性文庫(kù)時(shí)，可以采用電轉(zhuǎn)
化感受態(tài)細(xì)胞.ElectroTen-Blue細(xì)胞，是目前商品化的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)
細(xì)胞中效率最高的，達(dá)到>3 x 1010 轉(zhuǎn)化子/μg 超螺旋DNA。
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