仙桃學(xué)術(shù) | 2021年6 純生信老套路，煥發(fā)新春！亮點(diǎn)在這些美圖上，今天教你復(fù)現(xiàn)！
之前有小伙伴反饋說(shuō)基因家族太難，還是單基因好做一些。那么今天我們零代碼復(fù)現(xiàn)一篇今年發(fā)表在Frontiers in Oncology雜志上的單基因泛癌生信文章，該雜志最新影響因子已經(jīng)漲到了6.2分！話不多說(shuō)，動(dòng)手復(fù)現(xiàn)起來(lái)吧。主要展示了主變量ATG5在多種正常組織、腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況以及癌與癌旁、癌與正常組織中的表達(dá)差異情況。分析了ATG5對(duì)33種腫瘤總體生存的影響展示了ATG5在多種腫瘤中的免疫浸潤(rùn)分析（現(xiàn)在免疫浸潤(rùn)是生信分析的熱點(diǎn)，幾乎所有生信分析都可以靠一下~）展示了ATG5在多種腫瘤中與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性情況腫瘤微環(huán)境（TME）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）ATG5與DNA修復(fù)相關(guān)基因和甲基化的相關(guān)情況兩個(gè)表格展示了GSEA富集到KEGG/HALLMARK的top20條目本文數(shù)據(jù)量并不是很大，思路也很簡(jiǎn)單，現(xiàn)在如果加一些簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)完全是可以發(fā)的。我們先來(lái)進(jìn)行復(fù)現(xiàn)，復(fù)現(xiàn)過(guò)程中我們會(huì)額外補(bǔ)充一些零代碼出圖的分析，最后還會(huì)分享泛癌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的技巧。我們還是以生信分析神器：仙桃工具為主進(jìn)行復(fù)現(xiàn).
【高級(jí)版】 → 【立即使用】（注：免費(fèi)版和基礎(chǔ)版都可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和可視化，由于高級(jí)版功能最全，這里選擇高級(jí)版作為范例）。首先我們來(lái)復(fù)現(xiàn)表達(dá)差異的結(jié)果。在左側(cè)菜單欄“表達(dá)差異（挑）”模塊進(jìn)入，選擇“表達(dá)差異”菜單，下拉有“非配對(duì)樣本”和“配對(duì)樣本”兩種選擇我們以非配對(duì)樣本為例，點(diǎn)擊進(jìn)入頁(yè)面后，選擇“泛癌”疾病數(shù)據(jù)集，向右拖拽可以看到正常vs腫瘤，或者癌旁vs腫瘤。右側(cè)參數(shù)部分輸入分子，這里輸入“ATG5”，點(diǎn)擊“確認(rèn)”進(jìn)行繪圖。結(jié)果還不錯(cuò)，雖然表達(dá)差異倍數(shù)不是很大，但是在多數(shù)腫瘤中升高還是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。結(jié)果這里提供多種格式進(jìn)行下載，“保存結(jié)果”可以上傳到歷史記錄中，可直接用于后續(xù)拼圖。好用的拼圖功能已經(jīng)多次詳細(xì)展示了，這里就不再重復(fù)了，還不會(huì)的小伙伴可以查看之前的推文，有詳細(xì)操作過(guò)程~分析基因在正常組織/正常細(xì)胞中的表達(dá)情況我們使用的是HPA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/），我們還可以利用該數(shù)據(jù)庫(kù)增加一些原文沒有的分析結(jié)果，一起來(lái)看看吧。進(jìn)入首頁(yè)后，在檢索框中輸入主變量分子，點(diǎn)擊“Search”進(jìn)行檢索。由于只是基本檢索，結(jié)果會(huì)顯示所有模糊檢索到的內(nèi)容，但一般第一條就是我們想要的基因。點(diǎn)擊“Tissue”，可以查看ATG5在正常組織中的表達(dá)情況：點(diǎn)擊“Cell Type”，可以查看ATG5在正常細(xì)胞中的表達(dá)情況：此外，我們還可以“順手”增加一點(diǎn)分析。還是HPA數(shù)據(jù)庫(kù)剛才的頁(yè)面，點(diǎn)擊“Pathology”，進(jìn)入后向下翻，找到“PROTEIN EXPRESSION部分”，這里顯示了多種癌癥組織的免疫組化結(jié)果。關(guān)于HPA數(shù)據(jù)庫(kù)就不過(guò)多介紹了，解螺旋官網(wǎng)單元課中有該數(shù)據(jù)庫(kù)的詳細(xì)免費(fèi)教程，感興趣的小伙伴可以去學(xué)習(xí)一下~接下來(lái)是預(yù)后分析，回到仙桃工具，左側(cè)目錄中點(diǎn)擊“臨床意義（靠）”中的“預(yù)后分析”，展開后進(jìn)入“KM曲線圖”由于仙桃工具有記憶功能，所以分子不需要重復(fù)輸入。不過(guò)這里不能直接選擇泛癌，我們需要多次更換疾病。當(dāng)然，我們可以將結(jié)果保存或者下載，拼圖后就是原文的Figure3當(dāng)我們?cè)谒邪┓N中分析完，可以得到ATG5在各個(gè)癌種中的HR和p值，進(jìn)入“基礎(chǔ)繪圖”菜單，找到“森林圖”點(diǎn)擊進(jìn)入。這是需要上傳數(shù)據(jù)的，一般我們會(huì)下載示例數(shù)據(jù)，然后按照示例數(shù)據(jù)格式，將我們的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，如下這樣我們就得到了原文的Figure2，如果不喜歡默認(rèn)風(fēng)格可以在右側(cè)參數(shù)部分進(jìn)行更改。接下來(lái)是免疫浸潤(rùn)分析，在“交互網(wǎng)絡(luò)（聯(lián)）”中有“免疫浸潤(rùn)”，下拉后選擇“散點(diǎn)圖”。點(diǎn)進(jìn)去還是一樣的風(fēng)格，分子是輸入好的，然后不斷變換疾病即可如果想改變默認(rèn)風(fēng)格可以在右側(cè)參數(shù)中修改，鼠標(biāo)點(diǎn)一點(diǎn)就能實(shí)現(xiàn)，十分方便。此時(shí)我們可以保存結(jié)果，后面直接用仙桃工具拼圖，也可以下載PDF或者TIFF格式文件進(jìn)行保存。這里默認(rèn)展示T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，在參數(shù)中有一個(gè)“算法參數(shù)”欄，里面可以選擇細(xì)胞，可以按照原文選擇，也可以都進(jìn)行分析，最后選出比較好的結(jié)果進(jìn)行展示。提到免疫浸潤(rùn)，我們就再多講一點(diǎn)，這里還可以增加一些分析，豐富文章內(nèi)容。剛才復(fù)現(xiàn)原文使用的是“散點(diǎn)圖”模塊，我們可以再看一下“棒棒糖圖”通過(guò)調(diào)整參數(shù)，我們可以得到橫向的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)棒棒糖圖。這么好看的圖片放在文章中一定會(huì)為文章增色不少。其實(shí)仙桃工具還有“分組比較圖”模塊，感興趣的小伙伴可以試一下，也是一鍵出圖，十分方便~接下來(lái)我們繼續(xù)復(fù)現(xiàn)Figure5，ATG5在泛癌中與免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性熱圖。
如果要完全復(fù)現(xiàn)這張圖，首先我們要獲得相關(guān)系數(shù)。還是在“交互網(wǎng)絡(luò)（聯(lián)）”中，下拉“分子相關(guān)性分析”菜單，找到“單基因共表達(dá)熱圖”點(diǎn)擊進(jìn)入在右側(cè)參數(shù)的“分子列表”中輸入免疫檢查點(diǎn)基因，點(diǎn)擊確認(rèn)出圖。可以得到ATG5在單一腫瘤中的相關(guān)性熱圖。頁(yè)面繼續(xù)向下翻在結(jié)果說(shuō)明中，顯示了分子-分子相關(guān)性情況，其中有ATG5與其它分子的Pearson系數(shù)和Spearman系數(shù)以及對(duì)應(yīng)的p值，可以保存這些數(shù)值繪制相關(guān)性熱圖。在“基礎(chǔ)繪圖”中找到“相關(guān)性熱圖-相關(guān)矩陣”，按照示例數(shù)據(jù)格式將剛才保存好的數(shù)據(jù)整理好首先輸入的是Pearson系數(shù)或者Spearman系數(shù)，也就是相關(guān)系數(shù)在子數(shù)據(jù)表位置可以選擇“p值”的子數(shù)據(jù)表，然后將對(duì)應(yīng)的p值輸入上傳數(shù)據(jù)驗(yàn)證成功后，點(diǎn)擊“確認(rèn)”進(jìn)行出圖。在右側(cè)可以調(diào)整參數(shù)，得到個(gè)性化的結(jié)果圖片。對(duì)了，基礎(chǔ)繪圖的大部分模塊都有相應(yīng)的訓(xùn)練營(yíng)，可以聯(lián)系仙桃班主任進(jìn)行報(bào)名~接下來(lái)是TME和MSI的雷達(dá)圖，目前仙桃工具可以繪制雷達(dá)圖，但是還沒有上線TME和MSI泛癌的在線分析，如果大家有相關(guān)數(shù)據(jù)，可以進(jìn)入“基礎(chǔ)繪圖”中，點(diǎn)擊“雷達(dá)圖”進(jìn)入我們先來(lái)上傳示例數(shù)據(jù)出圖，看一下可以得到什么樣的圖片。這里可以得到三個(gè)基因在多個(gè)分組中的相關(guān)性情況，如果只輸入一個(gè)基因，將分組換成泛癌即可得到原文中的圖片，敬請(qǐng)關(guān)注仙桃工具后續(xù)更新接下來(lái)是Figure7，ATG5與DNA修復(fù)相關(guān)基因在泛癌中的相關(guān)性，與剛才免疫檢查點(diǎn)基因類似，只要將分子列表更換一下即可，這里就不再重復(fù)演示了。這里第二張小圖是ATG5在泛癌中甲基化的情況，這里我們沒有完全復(fù)現(xiàn)，但是可以利用仙桃工具展示更多更美觀的圖片在“交互網(wǎng)絡(luò)（聯(lián)）”中可以看到“DNA甲基化”，下拉菜單，點(diǎn)擊“分子表達(dá)相關(guān)性”選擇疾病的位置沒有變，不過(guò)輸入分子的框在疾病的下方，輸入分子名稱和探針，這里可以逐個(gè)輸入探針，選擇結(jié)果比較好的進(jìn)行展示這樣就可以得到ATG5在各個(gè)腫瘤中甲基化的相關(guān)性結(jié)果，最后篩選結(jié)果比較好的圖片拼到一起展示即可最后我們來(lái)看一下Figure8，GSEA富集分析。原文是根據(jù)ATG5的表達(dá)高低分組，然后找出差異基因，接下來(lái)對(duì)這些差異基因進(jìn)行GSEA富集。這一點(diǎn)仙桃工具也可以零代碼輕松實(shí)現(xiàn)，不過(guò)由于仙桃工具的這個(gè)模塊目前還沒有收錄泛癌的數(shù)據(jù)，所以我們需要分別獲取數(shù)據(jù)，最后整理到一起選擇“表達(dá)差異（挑）”，下拉“差異分析”菜單，點(diǎn)擊“單基因差異分析”進(jìn)入分子仍然不需要輸入，只需要選擇疾病，我們這里隨機(jī)以宮頸癌為例進(jìn)行演示，點(diǎn)擊“確認(rèn)”提交分析該分析結(jié)果需要一點(diǎn)時(shí)間，但一般3-5min就可以了喝杯茶的功夫再點(diǎn)擊上方的“歷史記錄”查看，分析已經(jīng)完成了下載后查看一下，可以看到差異基因表很全，gene symbol、ensembl ID、logFC、padj。其實(shí)GSEA分析只需要輸入gene symbol和logFC即可。接下來(lái)我們可以用同樣的方法分析多種癌癥的ATG5分組的差異基因，匯總后可以直接去掉重復(fù)值，也可以將重復(fù)值的logFC取平均值之后進(jìn)行GSEA富集分析，仙桃工具可以一鍵分析 可視化出圖。進(jìn)入“功能聚類（圈）”，下拉“GSEA富集”，首先點(diǎn)擊“GSEA分析”整理數(shù)據(jù)，id這列是gene symbol，value可以輸入logFC值將整理好的數(shù)據(jù)上傳，右側(cè)參數(shù)可以選擇默認(rèn)點(diǎn)擊確認(rèn)提交后，這個(gè)分析也大概需要1min的時(shí)間即可完成完成后在歷史記錄中可以下載完整的GSEA表格，即為原文中的table。繼續(xù)進(jìn)行GSEA可視化可以直接點(diǎn)擊左側(cè)菜單欄的“GSEA可視化”進(jìn)入后直接即可看到剛才進(jìn)行的GSEA富集分析，點(diǎn)擊“確認(rèn)”進(jìn)行可視化出圖如果想要改變可視化的條目，可以在右側(cè)參數(shù)部分進(jìn)行設(shè)置在參數(shù)的“基本參數(shù)”中可以填寫“基因集ID”，可以在剛才保存的GSEA富集分析結(jié)果中選擇想要展示的條目粘貼到這里如果我們想要對(duì)比多個(gè)結(jié)果的話，可以進(jìn)行山巒圖可視化。仍然是在GSEA富集模塊，工具不久前更新的“GSEA山巒圖”點(diǎn)進(jìn)去的界面與GSEA可視化相同，直接點(diǎn)擊“確認(rèn)”就可以得到非常漂亮的山巒圖了，可以與上一步得到的可視化圖片聯(lián)合展示到此我們復(fù)現(xiàn)結(jié)束啦，本文工作量不是很大，在復(fù)現(xiàn)過(guò)程中又給大家推薦了幾個(gè)可以增加的內(nèi)容，使用仙桃工具都可以輕松出圖。最后和大家分享一下泛癌如何補(bǔ)實(shí)驗(yàn)~其實(shí)泛癌的文章并不需要將所有癌種的實(shí)驗(yàn)都做到，只要做其中典型的幾種就可以。比如挑選表達(dá)差異結(jié)果比較高的癌癥，最簡(jiǎn)單的就是在臨床收一些癌vs癌旁的組織，可以提取RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，或者做免疫組化；還可以選一些細(xì)胞系，不需要任何操作，養(yǎng)起來(lái)就直接收細(xì)胞檢測(cè)目的基因的表達(dá)，不過(guò)需要正常細(xì)胞系作為對(duì)照。如果稍微復(fù)雜一點(diǎn)的，可以構(gòu)建敲低/過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入細(xì)胞（轉(zhuǎn)染、感染均可）后做些簡(jiǎn)單的功能實(shí)驗(yàn)，比如CCK8檢測(cè)增殖、流式分析細(xì)胞周期等等。我們也推出了許多仙桃工具相關(guān)的訓(xùn)練營(yíng)，包括但不限于基礎(chǔ)班訓(xùn)練營(yíng)、高級(jí)版訓(xùn)練營(yíng)、文章復(fù)現(xiàn)訓(xùn)練營(yíng)、分模塊教學(xué)的快閃營(yíng)、寫作工具訓(xùn)練營(yíng)等等，還沒有入手高級(jí)版的小伙伴們不要猶豫了，早買早發(fā)文，也祝大家早日發(fā)表屬于自己的生信文章！6 純生信老套路復(fù)現(xiàn)流程太詳細(xì)了吧~
自己也想成為套路的王者，如何能學(xué)到這套路呢？
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