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從小白的角度，30分鐘復(fù)現(xiàn)生信套路。今天為大家?guī)硪黄?020年9月發(fā)表于International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease的生信文章《Construction of Potential miRNA–mRNA Regulatory Network in COPD Plasma by Bioinformatics Analysis》的復(fù)現(xiàn)。

文獻(xiàn)總覽

本文是一篇挖掘GEO數(shù)據(jù)庫的純生信文章，涉及9個(gè)圖片，3張表格，用到的數(shù)據(jù)集是GPL570平臺(tái)的GSE56768，GPL9040平臺(tái)的GSE24709、GSE61741、GSE31568。

9張圖包括：

分析流程圖
差異表達(dá)miRNA的篩選
差異表達(dá)miRNA潛在轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)
差異表達(dá)miRNA潛在靶基因的預(yù)測(cè)
靶基因的GO富集分析
靶基因的KEGG富集分析
靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)
miRNA-hub gene網(wǎng)絡(luò)
前12 hub genes在GSE56768中的表達(dá)

3張表包括：

本研究所用芯片信息
差異表達(dá)miRNA潛在靶基因
潛在靶基因中的hub genes

圖一&表一：分析流程圖和芯片信息

圖二：差異表達(dá)miRNA的篩選

下載GSE24709、GSE61741、GSE31568表達(dá)矩陣，以GSE24709為例：

進(jìn)入GEO網(wǎng)站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，檢索GSE24709：

點(diǎn)擊“series matrix files”：

點(diǎn)擊“GSE24709_series_matrix.txt.gz”：

打開“GSE24709_series_matrix.txt”：

將表達(dá)矩陣部分復(fù)制粘貼到新表格，并刪掉肺癌樣本數(shù)據(jù)，只保留normal樣本和COPD樣本：

新建一個(gè)sheet，整理出樣本名對(duì)應(yīng)的組別：

進(jìn)入仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站https://www.xiantao.love/products。進(jìn)入主頁，選擇高級(jí)版，點(diǎn)擊“立即使用”。

（注：免費(fèi)版和基礎(chǔ)版都可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和可視化，由于高級(jí)版功能最全，這里選擇高級(jí)版作為范例）

選擇“分析工具”后，在左側(cè)選擇“表達(dá)差異”下的“復(fù)雜熱圖”，參數(shù)選擇如下圖所示：

即可復(fù)現(xiàn)Figure 2A：

Figure 2B、C根據(jù)同樣的操作即可復(fù)現(xiàn)。

回到GEO網(wǎng)站的GSE24709檢索結(jié)果頁面，點(diǎn)擊“analyze with GEO2R”：

分別定義組別COPD、normal，并對(duì)樣本賦予組別：

下載差異分析表格：

打開該表格：

按“|LogFC|>1.5 and an adjusted P value <0.05”對(duì)其進(jìn)行篩選：

另外兩個(gè)芯片的差異分析也是同樣的操作。

將GSE24709、GSE61741、GSE31568的DEMs整理成表格：

回到仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站，選擇“分析工具”后，在左側(cè)選擇“基礎(chǔ)繪圖”下的“韋恩圖”，上傳該表格，點(diǎn)擊確認(rèn)：

即可復(fù)現(xiàn)Figure 2D：

點(diǎn)擊“excel表格下載”，得到9個(gè)交集的DEMs：

在GSE24709、GSE61741、GSE31568的差異分析表格中分別檢索以上9個(gè)交集的DEMs，找到其對(duì)應(yīng)的logFC。另外，可以注意到以上9個(gè)交集的DEMs中有一些miRNA的命名中帶有星號(hào)，到miRBase網(wǎng)站中進(jìn)行轉(zhuǎn)換。分別檢索hsa-miR-182*、hsa-miR-126*、hsa-miR-130b*：

發(fā)現(xiàn)hsa-miR-182*最新ID為hsa-miR-182-3p：

發(fā)現(xiàn)hsa-miR-126*最新ID為hsa-miR-126-5p：

發(fā)現(xiàn)hsa-miR-130b*最新ID為hsa-miR-130b-5p：

另外檢索hsa-miR-1468和hsa-miR-497發(fā)現(xiàn)分別有兩個(gè)成熟序列：

回到差異分析表格中比對(duì)序列，發(fā)現(xiàn)其實(shí)分別是hsa-miR-1468-5p和hsa-miR-497-5p：

將檢索結(jié)果整理成表格：

然后回到仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站，選擇“分析工具”后，在左側(cè)選擇“差異表達(dá)”下的“復(fù)雜熱圖”，上傳該表格，點(diǎn)擊確認(rèn)：

即可復(fù)現(xiàn)Figure 2E：

PS：至于hsa?miR?126?5p的結(jié)果為什么和原文不一致，這應(yīng)該是作者的失誤。

圖四&表二：差異表達(dá)miRNA潛在靶基因的預(yù)測(cè)

打開miRNet網(wǎng)站https://www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml，點(diǎn)擊miRNAs：

輸入上調(diào)交集DEMs，點(diǎn)擊submit和proceed：

點(diǎn)擊mir2gene和proceed：

點(diǎn)擊SVG Format下載圖片：

打開下載的mir2gene表格：

即可整理出靶基因的數(shù)量。下調(diào)交集DEMs也是同樣的操作。即可復(fù)現(xiàn)Figure 4和Table 2。

圖三：差異表達(dá)miRNA潛在轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)

Funrich預(yù)測(cè)不了miRNA的轉(zhuǎn)錄因子，該文獻(xiàn)應(yīng)該寫錯(cuò)了，猜測(cè)應(yīng)該是用Funrich預(yù)測(cè)的miRNA靶基因的轉(zhuǎn)錄因子。

打開Funrich 3.1.3軟件，點(diǎn)擊“gene enrichment”，“add dataset”：

輸入上調(diào)的交集DEMs的靶基因：

點(diǎn)擊analysis，選擇transcription factor，點(diǎn)擊OK：

得到Figure 3A：

下調(diào)的交集DEMs也是同樣的操作，即可復(fù)現(xiàn)Figure 3B。

圖五&圖六：靶基因的GO和KEGG富集結(jié)果

在仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站的“分析工具”頁面選擇 “功能聚類”下的“GO|KEGG 富集分析”，下載示例數(shù)據(jù)：

將之前得到的靶基因復(fù)制到該表格中

上傳該表格，在參數(shù)欄中選擇全部GO+KEGG，點(diǎn)“確認(rèn)”：

得到分析結(jié)果，保存結(jié)果，并下載Excel表：

對(duì)富集結(jié)果表格按照“adjusted P < 0.05”的條件進(jìn)行篩選：

從GO-BP、GO-CC、GO-MF條目中分別挑選一些自己想要展示的條目。然后選擇仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站左側(cè)的“功能聚類”下的“GO|KEGG 可視化”，選擇剛才保存的富集分析結(jié)果，選擇圖片類型為柱狀圖，將GO條目輸入到紅框中，并選擇分面：

即可復(fù)現(xiàn)Figure 5A：

圖片類型改為氣泡圖，即可復(fù)現(xiàn)Figure 5B：

輸入想要展示的KEGG條目，圖片類型選擇柱狀圖或氣泡圖，“不分面”，即可復(fù)現(xiàn)Figure 6：

圖七和表三：靶基因的PPI分析

打開string數(shù)據(jù)庫：

將上調(diào)DEMs的靶基因復(fù)制到list of names中，organism選擇“homo sapiens”，檢索（因?yàn)镾tring不支持輸入基因超過2000個(gè)，所以只選擇1000個(gè)基因進(jìn)行后續(xù)分析）：

點(diǎn)擊continue：

導(dǎo)出互作表格：

打開Cytoscape軟件（3.8.0），載入互作表格：

點(diǎn)擊OK：

點(diǎn)擊cytohubba，點(diǎn)擊calculate：

輸入Top 30，選擇“MCC算法”，點(diǎn)擊submit：

點(diǎn)擊style，選擇圓形，點(diǎn)擊apply：

即可復(fù)現(xiàn)Figure 7A：

根據(jù)同樣的操作，即可復(fù)現(xiàn)Figure 7B。

在軟件下方點(diǎn)擊最右側(cè)的表格，復(fù)制該表格：

按照MCC進(jìn)行降序排序：

即可得到MCC算法下上調(diào)DEMs靶基因的top 10 hub genes及其score。

根據(jù)同樣的操作即可得到MCC算法下下調(diào)DEMs靶基因的top 10 hub genes及其score。整理成表格，即可復(fù)現(xiàn)Table 3。

圖八：miRNA-hub gene網(wǎng)絡(luò)

打開之前在miRNet網(wǎng)站檢索到的靶基因表格，分別搜索上/下調(diào)DEMs靶基因的top 10 hub genes對(duì)應(yīng)的DEMs，整理成表格miRNA-hub gene。

新建一個(gè)表格color，第一列為miRNA-hub gene表格中的分子，第二列為上下調(diào)狀態(tài)：

新建一個(gè)表格shape，第一列為miRNA-hub gene表格中的分子，第二列為分子類型：

打開cytoscape（3.8.0）軟件，載入miRNA-hub gene表格：

點(diǎn)擊OK：

點(diǎn)擊File——import——table from file，導(dǎo)入color表格和shape表格：

在style中點(diǎn)擊fill color，選擇column參數(shù)為DE，mapping type參數(shù)為discrete mapping，DOWN參數(shù)為綠色，UP參數(shù)為紅色：

點(diǎn)擊shape，選擇column參數(shù)為Kind，mapping type參數(shù)為discrete mapping，gene參數(shù)為diamond，miRNA參數(shù)為ellipse：

即可得到Figure 8：

圖片可以導(dǎo)出（點(diǎn)擊File——Export——Network to Image）：

圖九：前12個(gè)hub gene在GSE56768中的表達(dá)

GEO網(wǎng)站檢索GSE56768：

下載表達(dá)矩陣：

下載GPL570注釋文件：

打開平臺(tái)注釋文件，檢索hub gene RPS25，發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的探針號(hào)200091_s_at：

打開表達(dá)矩陣表格，檢索探針號(hào)200091_s_at：

復(fù)制該行數(shù)據(jù)以及樣本名行、樣本特點(diǎn)行到一個(gè)新的表格：

對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)置：

通過篩選功能保留COPD樣本和Smoker樣本：

并按降序排列：

將該表的第一列和第三列復(fù)制到一個(gè)新表中：

回到仙桃學(xué)術(shù)，在 “分析工具”頁面選擇 “基礎(chǔ)繪圖”下的“分組比較圖”，上傳該表格，選擇點(diǎn)圖，Y軸標(biāo)題輸入RPS25，點(diǎn)擊確認(rèn)：

即可得到結(jié)果：

其余11個(gè)hub gene的表達(dá)也是同樣的操作，即可復(fù)現(xiàn)Figure 9。

好了，本期零代碼生信文章復(fù)現(xiàn)就到這里啦！有沒有覺得仙桃學(xué)術(shù)的工具很贊很奈斯？希望大家好好利用這個(gè)寶藏，多多發(fā)文章~

3+SCI套路，零代碼搞定，復(fù)現(xiàn)的太精彩了吧~

請(qǐng)問有沒有更多的文章復(fù)現(xiàn)？往下看~

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