獨(dú)家專(zhuān)訪 | 港科大團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)全腦基因編輯技術(shù)，可跨越血腦屏障，已驗(yàn)證可改善小鼠AD癥狀
根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，隨著世界人口老齡化，每年有近 1000 萬(wàn)阿爾茨海默癥新增病例。傳統(tǒng)的阿爾茨海默癥治療藥物只能緩解癥狀而不能改變疾病，因此科學(xué)家們開(kāi)始尋找替代策略。在使用 CRISPR-Cas9 進(jìn)行基因編輯方面取得突破后，該技術(shù)因其在操縱影響疾病的基因方面的潛力而引起了人們的興趣。然而，過(guò)去 15 年中有超過(guò) 400 項(xiàng)失敗的臨床試驗(yàn)。最近的一項(xiàng)分析表明，2002 年至 2012 年期間涉及阿爾茨海默癥的藥物臨床試驗(yàn)成功率僅為 0.4%，失敗率高達(dá) 99.6% 。近 20 年來(lái)，也只有渤健頗有爭(zhēng)議的新藥獲得 FDA 批準(zhǔn)上市。為攻克這一難題，今年 4 月，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院同意，召集阿爾茨海默氏癥和干細(xì)胞研究人員，共同開(kāi)展有史以來(lái)最大的基因組編輯項(xiàng)目。該計(jì)劃旨在幫助科學(xué)家更好地了解基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致阿爾茨海默癥的腦細(xì)胞損傷疾病和其他癡呆癥。近日，由香港科技大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)，美國(guó)加州理工學(xué)院以及中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的研究團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)了一種新型全腦基因編輯技術(shù)，不僅可以跨越血腦屏障，還可以提供優(yōu)化的基因組編輯系統(tǒng)。該技術(shù)已在小鼠模型中證明可以改善阿爾茨海默癥的病理癥狀。與此同時(shí)，科學(xué)家們還在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白（一種被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng) AD 神經(jīng)變性的蛋白質(zhì)）在治療后 6 個(gè)月內(nèi)（約為正常壽命的三分之一）保持低水平，這表明單次基因組編輯策略具有持久的效果。更重要的是，到目前為止，在小鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何副作用。這項(xiàng)研究以題為“Brain-wide Cas9-mediated cleavage of a gene causing familial Alzheimer’s disease alleviates amyloid-related pathologies in mice”發(fā)表在 Nature Biomedical Engineering 上。圖 | 葉玉如教授（右二）及團(tuán)隊(duì)成員（來(lái)源：受訪者）香港科技大學(xué)的葉玉如教授告訴生輝，“我們的全腦基因編輯系統(tǒng)是首次通過(guò)靜脈 AAV 遞送 Cas9 蛋白并實(shí)現(xiàn)高效的全腦基因編輯。實(shí)現(xiàn)了非侵入性的、長(zhǎng)期且高效的、全腦范圍的對(duì)家族性 AD 的精準(zhǔn)治療手段。”葉玉如是中國(guó)科學(xué)院院士、發(fā)展中國(guó)家科學(xué)院院士、美國(guó)國(guó)家科學(xué)院外籍院士、香港科學(xué)院創(chuàng)院院士，以及香港科技大學(xué)晨興生命科學(xué)教授、博士生導(dǎo)師、副校長(zhǎng)。其研究主要集中于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能，以及阿爾茨海默癥、帕金遜癥等神經(jīng)退行性疾病的藥物研發(fā)。首次非侵入方式實(shí)現(xiàn)全腦基因編輯
葉玉如：我們開(kāi)發(fā)了一種新型跨血腦屏障的全腦基因編輯系統(tǒng)，通過(guò)非侵入式的靜脈注射途徑給藥，突破以往常規(guī)的腦定位局部注射、腦脊液注射等侵入式的基因治療給藥方式。首次成功通過(guò)靜脈注射實(shí)現(xiàn)高效的全腦基因編輯，長(zhǎng)期緩解了阿爾茨海默癥的相關(guān)病理，并提高認(rèn)知能力。通俗來(lái)說(shuō)，基因中的致病突變類(lèi)似寫(xiě)文章中的錯(cuò)別字，基因編輯類(lèi)似錯(cuò)別字的修正。以往的局部注射只能修改一個(gè)段落的錯(cuò)別字，而現(xiàn)在的全腦基因編輯可以做到一次性修改一本書(shū)的錯(cuò)別字，大幅度提高了修改效率。生輝：腺相關(guān)病毒目前仍是體內(nèi)主要的遞送工具，但是穿越血腦屏障也是遞送中的一大難點(diǎn)。論文中顯示，團(tuán)隊(duì)采用 AAV 遞送基因編輯工具穿越血腦屏障，請(qǐng)問(wèn)具體是如何實(shí)現(xiàn)的？葉玉如：我們和加州理工大學(xué)的 Viviana Gradinaru 教授合作解決腺相關(guān)病毒（AAV）穿越血腦屏障這一難點(diǎn)。他們開(kāi)發(fā)了名為 M-CREATE，基于 Cre 重組的 AAV 靶向進(jìn)化（Cre recombination-based AAV targeted evolution, CREATE）的篩選病毒衣殼的技術(shù)，從而篩選出更加高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)體內(nèi)表達(dá) Cre 的細(xì)胞群體的 AAV 病毒衣殼。他們利用 M-CREATE 整合新一代的測(cè)序技術(shù)、合成文庫(kù)生成及專(zhuān)用的分析通路技術(shù)，識(shí)別能廣泛轉(zhuǎn)化中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衣殼突變體，并通過(guò)對(duì)數(shù)千種其它衣殼突變體的適合度進(jìn)行排序，篩選出了能夠進(jìn)入血液中并自由通過(guò)血腦屏障的新的衣殼，制備出了跨越血腦屏障的新型 AAV，實(shí)現(xiàn)了只需一針注射，就能非侵入、高效地將效應(yīng)基因傳遞至大腦特定細(xì)胞類(lèi)型的提送能力。生輝：論文中提到，優(yōu)化了基因編輯工具，請(qǐng)問(wèn)是如何優(yōu)化的？與現(xiàn)有的基因編輯工具相比，有什么優(yōu)勢(shì)？葉玉如：優(yōu)化基因編輯工具是實(shí)現(xiàn)全腦基因編輯的關(guān)鍵。我們對(duì)基因編輯工具的優(yōu)化主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面。一方面是我們的基因編輯體系是一體化的（all-in-one）。目前常用于基因編輯的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是改良自釀膿鏈球菌，其大小超出了腺相關(guān)病毒的包裝限制，通常需要兩個(gè)腺相關(guān)病毒分別遞送 Cas9 蛋白和向?qū)?RNA（guide RNA）。這大大降低了體內(nèi)編輯效率，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)病理癥狀的有效治療。而我們用的新型 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，是改良自金黃葡萄球菌，其大小可以實(shí)現(xiàn) all-in-one 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因編輯，大幅度提高體內(nèi)基因編輯效率。另一方面，我們?cè)谙傧嚓P(guān)病毒 5kb 的載體限制范圍內(nèi)，增加了 CRIPSR 活性的“增強(qiáng)子”，有效增強(qiáng)了 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的表達(dá)能力，使我們的基因編輯工具在基因遞送拷貝數(shù)較低的條件下仍然能高效表達(dá)。對(duì)基因編輯工具的優(yōu)化解決了全腦基因編輯體系“卡脖子”的技術(shù)難點(diǎn)，在全腦實(shí)現(xiàn)高效基因編輯并改善 AD 神經(jīng)退行病變的病理癥狀。生輝：在研究過(guò)程中，遇到的困難能否分享一下？葉玉如：在研究過(guò)程中我們遇到了許多的困難。其中印象最深刻的是最初的時(shí)候我們的全腦基因編輯系統(tǒng)無(wú)法有效地進(jìn)行基因編輯。我們對(duì)比了其他的一些能全腦表達(dá)的載體，才發(fā)現(xiàn)我們的基因編輯系統(tǒng)缺失了一個(gè)能在基因遞送拷貝數(shù)較低的條件下增強(qiáng)基因表達(dá)的一個(gè)元件。這個(gè)元件的缺失在對(duì)局部腦區(qū)進(jìn)行基因編輯的情況下是不會(huì)造成很大的影響的。這告訴我們?cè)陂_(kāi)發(fā)新技術(shù)的時(shí)候要注意到方方面面，往往細(xì)節(jié)決定成敗。“將關(guān)注全腦基因編輯的安全性”
生輝：阿爾茨海默癥在學(xué)術(shù)界乃至產(chǎn)業(yè)界，在近 20 年里，只有渤健頗受爭(zhēng)議的新藥獲得 FDA 批準(zhǔn)上市，目前熱門(mén)的 tau 蛋白假說(shuō)和 Aβ 假說(shuō)也未得到驗(yàn)證，請(qǐng)問(wèn)，您在編輯相關(guān)基因的時(shí)候，如何選擇基因？出于什么考慮？葉玉如：越來(lái)越多研究表明阿爾茨海默癥是一種病因復(fù)雜的腦疾病，無(wú)法找到一個(gè)通用的發(fā)病假說(shuō)或藥物治療所有患者，因此亟需針對(duì)疾病亞型開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)的治療方法，比如說(shuō)家族性阿爾茨海默癥 (FAD)這種與家族史高度相關(guān)的先天性的阿爾茨海默癥的遺傳病因是明確的，而且可以通過(guò)基因測(cè)序進(jìn)行早期診斷，目前針對(duì)這一類(lèi) AD 患者缺乏有效的治療方法。位于淀粉樣前體蛋白、早老素 1 和早老素 2 的 FAD 遺傳突變可以直接導(dǎo)致阿爾茨海默癥的相關(guān)病癥。所以，我們認(rèn)為直接消除或修復(fù) FAD 遺傳突變，從根源上治療和緩解 FAD，可以成為治療 FAD 的精準(zhǔn)干預(yù)策略。據(jù)估計(jì)，現(xiàn)在中國(guó)有超過(guò) 500,000 名潛在的 FAD 患者。我們是希望能夠給這類(lèi)患者提供治療機(jī)會(huì)。生輝：這項(xiàng)研究的思路、想法是受到什么啟發(fā)？葉玉如：正如同我們剛剛說(shuō)到的那樣，家族性阿爾茨海默癥 (FAD) 是與家族史高度相關(guān)的一類(lèi)阿爾茨海默癥，是由淀粉樣前體蛋白 (APP)、早老素 1 和早老素 2 的基因突變引起，導(dǎo)致淀粉樣蛋白 β（Aβ）過(guò)度產(chǎn)生的遺傳病。盡管 FAD 的病因相對(duì)清楚而且可以在認(rèn)知障礙發(fā)生之前進(jìn)行診斷，但目前尚無(wú)針對(duì) FAD 的有效治療方法。CRISPR/Cas9 等基因編輯技術(shù)的發(fā)展使得通過(guò)精準(zhǔn)治療直接消除或修復(fù)遺傳突變，從根源上治療和緩解遺傳病成為可能。但由于 FAD 產(chǎn)生的神經(jīng)退行性病變廣泛影響大腦皮層和海馬等多個(gè)腦區(qū)，單一的腦定位局部注射無(wú)法對(duì)像 FAD 這樣影響多個(gè)腦區(qū)的疾病產(chǎn)生廣泛且有效的治療效果。因此，我們希望能夠?qū)崿F(xiàn)全腦范圍的高效基因編輯，改善 AD 的病理癥狀，修復(fù) AD 認(rèn)知功能障礙。生輝：論文中表示，在基因編輯后，大腦中被認(rèn)為引發(fā) AD 神經(jīng)退行病變的淀粉樣蛋白斑塊，仍然保持較低水平，這是否意味著只能減緩 AD 的發(fā)生，并不能完全阻止或者中止？葉玉如：可以這樣說(shuō)。一方面是因?yàn)槲覀兪窃谛∈箝_(kāi)始產(chǎn)生淀粉樣蛋白斑塊后開(kāi)始治療，接受了基因編輯的細(xì)胞會(huì)停止產(chǎn)生淀粉樣蛋白斑塊。但原有的淀粉樣蛋白斑塊無(wú)法通過(guò)基因編輯直接消除；另一方面，β-淀粉樣蛋白（Aβ）在腦內(nèi)的產(chǎn)生和清除一直處于動(dòng)態(tài)平衡，F(xiàn)AD 的發(fā)生是由于平衡被打破，我們的研究表明將 Aβ 保持在較低水平，可以重新恢復(fù) Aβ 產(chǎn)生和清除的平衡，并在 AD 小鼠中產(chǎn)生長(zhǎng)期治療效果。所以，對(duì)于 AD 患者來(lái)說(shuō)，及早治療是至關(guān)重要的。特別是 FAD 患者是可以在認(rèn)知障礙發(fā)生之前進(jìn)行診斷的，相信及早治療會(huì)有效提高治療效果。圖 | 患有神經(jīng)退行病變的小鼠大腦（左圖）中存有大量被認(rèn)為是引發(fā)AD元兇的淀粉樣蛋白斑塊，在進(jìn)行基因編輯治療后，相關(guān)的白色陰影明顯下降（右圖）生輝：利用基因編輯的方式糾正引發(fā)疾病的基因突變，能夠達(dá)到一次治療、長(zhǎng)期有效，但是，如果基因編輯有誤，后續(xù)無(wú)法校正，這也是現(xiàn)在 RNA 編輯比較熱門(mén)的原因，請(qǐng)問(wèn)你如何看待這個(gè)問(wèn)題？葉玉如：基因編輯和 RNA 編輯各有利弊?；蚓庉嬙凇耙淮沃委煛㈤L(zhǎng)期有效” 方面有它的獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。雖然基因編輯如果出錯(cuò)，后續(xù)很難校正，但是在基因編輯作為治療手段進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前，會(huì)在細(xì)胞系、動(dòng)物模型中進(jìn)行大量的安全測(cè)試，在確保安全有效的前提下，才會(huì)對(duì)患者進(jìn)行治療。所以能夠進(jìn)入臨床的基因編輯手段應(yīng)該是安全無(wú)誤的。RNA 編輯確實(shí)因?yàn)槌掷m(xù)時(shí)間比較短，所以如果出現(xiàn)錯(cuò)誤，可以及時(shí)停止。但是 RNA 編輯對(duì)于那些長(zhǎng)期影響生活的疾病的治療效果可能就沒(méi)有基因編輯的效果好，需要反復(fù)給藥?？偟膩?lái)說(shuō)，基因編輯對(duì)于長(zhǎng)期影響生活的疾病可能會(huì)更合適一些，而RNA編輯可能對(duì)階段性發(fā)病的疾病比較合適。另一方面，基因編輯和 RNA 編輯的安全性還需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將基因編輯和RNA編輯運(yùn)用于臨床還有很長(zhǎng)的路要走。葉玉如：正如同我們剛剛說(shuō)到的那樣，基因編輯的安全性需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。我們下一階段的研究計(jì)劃就會(huì)著重關(guān)注全腦基因編輯的安全性。我們也會(huì)觀察全腦基因編輯對(duì) AD 小鼠的長(zhǎng)期影響。同時(shí)我們會(huì)利用不同種類(lèi)的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)所有的 FAD 遺傳突變做一個(gè)系統(tǒng)性的篩查，確保我們能利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)消除或修復(fù)每個(gè)遺傳突變，實(shí)現(xiàn)全覆蓋的精準(zhǔn)化個(gè)性化治療。生輝：實(shí)驗(yàn)室的其它課題能否分享一下？可能有哪些臨床應(yīng)用？葉玉如：我們實(shí)驗(yàn)室致力于實(shí)現(xiàn)針對(duì)阿爾茲海默癥的多種關(guān)鍵靶點(diǎn)的藥物研發(fā)。除了新型的基因治療手段之外，實(shí)驗(yàn)室也在篩選和研發(fā)傳統(tǒng)的小分子和抗體治療藥物，例如：白細(xì)胞介素-33 靶向降低腦中整體炎癥反應(yīng)的水平；從中藥中篩選得到的鉤藤堿可以抑制 EphA4 受體活性，提高突觸可塑性。除了藥物研發(fā)之外，我們還在研究 AD 患者的遺傳信息和血漿里的生物標(biāo)志物信息。我們也希望通過(guò)整合這些信息可以實(shí)現(xiàn)阿爾茲海默癥的早期診斷。畢竟，對(duì)于 AD 患者來(lái)說(shuō)，及早治療是至關(guān)重要的。參考資料：
- Yangyang Duan, Tao Ye, Zhe Qu, Yuewen Chen, Abigail Miranda, Xiaopu Zhou, Ka-Chun Lok, Yu Chen, Amy K. Y. Fu, Viviana Gradinaru, Nancy Y. Ip. Brain-wide Cas9-mediated cleavage of a gene causing familial Alzheimer’s disease alleviates amyloid-related pathologies in mice. Nature Biomedical Engineering, 2021; DOI: 10.1038/s41551-021-00759-0
- https://www.synthego.com/blog/alzheimers-crispr
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